Ключевые слова: гипертоническая болезнь, мембраны лимфоцитов, белок клеточной адгезии NCAM/CD56

Артериальная гипертензия (АГ) является наиболее распространенным сердечно-сосудистым заболеванием в мире во взрослой популяции и по данным ВОЗ регистрируется у 15–30 % населения [1]. Цереброваскулярные осложнения во многом определяют прогноз больных с АГ. Наблюдается тесная зависимость между АГ и частотой инсультов: риск возникновения инсультов прямо коррелирует с уровнем как систолического, так и диастолического артериального давления (АД) [18]. Согласно результатам Фремингемского исследования, повышение АД ассоциируется с повышением риска развития инсультов в 5–30 раз в разных возрастных группах [17]. В настоящее время инсульт в развитых странах – одна из ведущих причин смерти и инвалидизации пациентов с АГ [3], поэтому поиск маркеров раннего прогнозирования вероятности развития клинических состояний у больных с АГ весьма актуален.

Адгезия клеток является исключительно важной в процессах формирования и развития живых организмов в норме и при патологических изменениях [5]. В настоящее время интенсивно изучается роль молекул клеточной адгезии в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, в частности атеросклероза и ишемической болезни сердца. Адгезивные молекулы ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1 инициируют повышение проницаемости интимы, клеточную инфильтрацию стенки сосуда воспалительными клетками и их активацию, что обусловливает активную пролиферацию гладкомышечных клеток и продукцию ими соединительной ткани, составляющей основу фиброзной капсулы атеросклеротической бляшки [9]. Нарушение функции эндотелия прямо коррелирует с резким увеличением экспрессии молекул адгезии, обеспечивающих контакт, адгезию клеток на эндотелий [4, 9]. Имеются данные о повышении содержания VCAM-1s, экспрессируемых эндотелиемсосудов, у больных с нестабильной стенокардией, что может быть обозначено как гуморальный маркер дисфункции эндотелия [15].

Головной мозг – один из основных органов-мишеней при АГ [18]. Взаимосвязь между нейронами в центральной нервной системе (ЦНС) происходит при помощи нейрональных молекул клеточной адгезии (neural cell adhesion molecule – NCAM), которые относятся к иммуноглобулиновому суперсемейству и осуществляют кальцийнезависимую адгезию [12]. Мембранный гликопротеин CD56 экспрессируется на всех лимфоцитах, осуществляющих генетически нерестриктированный лизис клеток-мишеней, и является изоформой NCAM [14]. NCAM/CD56-антиген (140 кДа) является изоформой молекулы адгезии нервных клеток. Он обнаруживается в различных сайтах, включая нервную ткань, нейромускульные пластинки, нейроэндокринные и эндокринные органы [5]. На сегодняшний день рассматриваются также перспективы применения молекул клеточной адгезии (МКА) в клинико-диагностических целях. МКА, в том числе нейрональные, играют ключевую роль в процессах морфогенеза и развития организма [5].

NCAM идентифицирована на плазматических мембранах нейронов и астроглиальных клеток [5]. Экспрессия NCAM выявлена также на миоцитах в зоне нервно-мышечного контакта, на лимфоцитах, органах эндокринной, репродуктивной и мочевыделительной систем, NCAM140 найден на клетках эндотелия микрососудов человека [2]. Показано, что NCAM обладают Ca2+, Mg2+-зависимой АТФ-азной активностью [5]. Уровень NCAM возрастает при патологических состояниях различного генеза [5]. Однако в настоящее время отсутствуют данные об изменении содержания NCAM у пациентов с гипертонической болезнью (ГБ).

Цель исследования – оценка характера изменений NCAM/CD56 в мембранной фракции лимфоцитов у пациентов с различными клиническими вариантами течения ГБ.

Материал и методы

Обследованы 28 пациентов с ГБ II и III стадии (по классификации ВОЗ, 1999) в возрасте 46–73 лет, в среднем (54,13±3,72) года, средняя длительность заболевания составила (6,63±3,21) года. Диагноз верифицировали путем исключения симптоматической АГ. Обследованные были распределены на 4 группы: 1-ю составили 8 пациентов с ГБ II стадии, поражением головного мозга (гипертензивной дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭП) I–II стадии) и изменениями артерий глазного дна; 2-ю – 6 больных с гипертрофией левого желудочка (ГЛЖ); 3-ю – 8 пациентов с ГБ III стадии при достоверном подтверждении инсульта в анамнезе (1–10 лет); 4-ю – 6 пациентов с ГБ III стадии с постинфарктным кардиосклерозом. В контрольную группу вошли 6 практически здоровых лиц без отягощенной наследственности по АГ, сопоставимые по полу и возрасту. Гипертензивную ДЭП верифицировали на основании заключения невропатолога и подтверждали данными магнитно-резонансного исследования головного мозга. ГЛЖ оценивали согласно общепринятым критериям после проведения эхокардиографического исследования [1].

Содержание NCAM/CD56 в мембранной фракции лимфоцитов определяли в венозной крови, взятой натощак из локтевой вены через 3 дня после отмены лекарственных средств. Определение уровня NCAM/CD56 производили методом иммуноблоттинга с использованием моноспецифической кроличьей антисыворотки против NCAM (фирмы “Sigma”, США). Лимфоциты выделяли из суспензии клеток после центрифугирования в градиенте плотности верографин-феколла. Суспензию лимфоцитов (0,1 г) гомогенизировали при температуре 4 °С в 2 мл 0,025 моль трис-буфера (рН 8,0), содержащего 2 ммоль ЭДТА, 1 ммоль 2-меркаптоэтанола, 0,1 ммоль фенилметилсульфонилфторида и соевый ингибитор трипсина (10 мкг/мл). Гомогенат центрифугировали при 60 000 g в течение 60 мин. Супернатант (S1) содержал растворимые белки. Для солюбилизации мембранных белков полученный осадок ресуспендировали в 0,4 мл того же буфера, который дополнительно содержал 2 % тритона Х-100, эффективно экстрагирующего мембранные белки. После 30 мин экстракции повторно центрифугировали при тех же условиях. Электрофорез проводили в градиенте полиакриламида 7,5–17,5 % в присутствии 0,1 % додецилсульфата натрия по О.Н. Laemmli [13]. Определение полипептидного состава изоформ NCAM проводили методом иммуноблоттинга с применением моноспецифической антисыворотки, как описано ранее [5]. Содержание общего белка в экстрактах определяли методом Лоури в модификации Миллера [16]. Относительную интенсивность полипептидных зон оценивали с помощью компьютерной обработки сканированных результатов иммуноблоттинга.

Всем исследуемым проводили магнитно-резонансную томографию (МРТ) головного мозга на аппарате “Magnetom P8” (“Siemens”, Германия). Использовали последовательности спин-эха с получением Т1, Т2- и PD-взвешенных изображений. Для определения морфофункционального состояния миокарда и показателей центральной гемодинамики проводили эхокардиографию на аппарате “Sonos 1000” (США) по общепринятой методике. Статистическую обработку данных осуществляли путем корреляционного анализа и определения достоверности различий средних величин с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Во всех исследованных группах пациентов с ГБ II и III стадии выявлено достоверное повышение уровня нейроспецифического белка NCAM/CD56 в лимфоцитах по сравнению с практически здоровыми лицами (рис. 1). При этом уровень изменений колебался и был максимальным в 1-й группе, превышая значение этого показателя в контрольнойгруппе на 133,9 % (Р<0,001), а минимальным – в 2-й группе – 76,2 % (Р<0,01). Различий между пациентами с ГБ с идентичной клинической симптоматикой не выявлено. Однако обращает на себя внимание разнонаправленность динамики показателей в группах по мере прогрессирования заболевания, которая зависит от нарушений нервной либо сердечно-сосудистой системы: уровень NCAM/CD56 был выше в 1-й группе по сравнению с 3-й на 33,7 % (Р<0,01) и, наоборот, в 4-й по сравнению со 2-й – на 17, 5 % (Р<0,1). При ГБ II стадии с проявлениями ДЭП (1-я группа) зафиксировано достоверно более выраженное повышение содержания NCAM/CD56 в лимфоцитах по сравнению с таковым у пациентов с ГЛЖ (2-я группа) на 67,2 % (Р<0,01) и постинфарктным кардиосклерозом – на 42,2 % (Р<0,01).

Рис. 1. Содержание NCAM/CD56 у пациентов с гипертонической болезнью. Различия показателей достоверны по сравнению с таковыми: * – в контрольной группе (Р<0,001); D – 1-й группе (Р<0,01).

Обнаруженные различия, вероятно, отражают приоритетное влияние на уровень нейроспецифического белка клеточной адгезии изменений со стороны головного мозга. Для подтверждения данного предположения пациенты были объединены по принципу доминирующего клинического варианта течения заболевания: поражение головного мозга (ДЭП, инсульт), поражение сердца (ГЛЖ, инфаркт миокарда) (рис. 2). В обеих подгруппах зафиксировано достоверное повышение NCAM/CD56 по сравнению с данными в контрольной группе – соответственно на 104,9 % и 51,2 % (Р<0,01). Тем не менее содержание нейроспецифического белка в мембранной фракции лимфоцитов у пациентов с клиническими проявлениями нарушений состороны головного мозга на 35 % (Р<0,05) превышало уровень NCAM у другой категории больных.

Рис. 2. Содержание NCAM/CD56 у пациентов с различными вариантами течения гипертонической болезни. Различия показателей достоверны по сравнению с таковыми: * – у пациентов группы контроля (Р<0,01); D – у группы пациентов с поражением головного мозга (Р<0,05).

Для подтверждения выявленного факта использовали статистический метод оценки расчета c2-критерия Пирсона, который составил 68,36, превышая табличный уровень (41,34; Р<0,05), что свидетельствует о достоверном влиянии на оцениваемые параметры предложенного принципа разделения на группы. Выявленное повышение уровня NCAM/CD56 во 2-й и 4-й группе, вероятнее всего, связано с ГЛЖ и увеличением контактов нервная ткань–миокард, на что указывают корреляционные связи между содержанием NCAM/CD56 и толщиной задней стенки ЛЖ (r=0,82; Р<0,05), величиной конечно-диастолического объема (r=–0,89; Р<0,05) и конечно-систолического размера (r=0,65; Р<0,05). С другой стороны, не исключено, что повышение уровня NCAM/CD56 в лимфоцитах при ГБ II стадии у пациентов с проявлениями ГЛЖ, инфаркта миокарда обусловлено поражениями головного мозга без выраженных клинических проявлений.

Повышение содержания NCAM/CD56 у пациентов с ГБ II стадии ассоциировалось с поражением головного мозга (r=0,62; Р<0,05) по данным МРТ, соответствующим проявлениям ДЭП согласно общепринятым стандартным признакам МРТ. Наибольший уровень NCAM/CD56 был у больных с ДЭП, и соответственно у них наблюдали наиболее выраженные изменения головного мозга: у 2 больных выявили изолированное расширение желудочковой системы мозга, у 3 – расширение боковых желудочков в сочетании с узкими зонами гиперинтенсивности вокруг них и очагами повышенного в режиме Т2-сигнала. У пациентов с АГ, у которых по данным МРТ не было изменений со стороны головного мозга, содержание CD56 было достоверно меньшим. Среди больных с высоким уровнем NCAM/CD56 отмечена отягощенная наследственность в 64,2 % случаев, из них по линии матери – в 57,1 % и по линии отца – в 21,4 %.

Роль и функции NCAM/CD56 в организме до конца не выяснены, однако участие в гомофилической адгезии, а также присутствие на клетках некоторых опухолей, таких как множественная миелома, меланома и опухоли эпителиального происхождения, позволяют рассматривать этот антиген как биологический маркер патологических состояний [6]. Предполагается также, что для некоторых NCAM/CD56-положительных лимфоцитов может происходить инфильтрация в ЦНС и вследствие этого развитие патологических нарушений функции и структуры мозга [8]. После временной ишемии мозга количество клеток, экспрессирующих NCAM, увеличивается в гиппокампе. Существуют данные о возможности использования нейроспецифических белков NCAM и нейроспецифической энолазы в качестве прогностических маркеров инсульта и инфаркта [7]. При ишемии и повреждениях коры головного мозга обнаружено увеличение мРНК NCAM140 в реактивных астроглиальных клетках [10].

Модуляция адгезивных молекул иммуноглобулинового семейства, индуцированная временной глобальной ишемией, наблюдается кратковременно в нейронах и более длительна в глиальных клетках. Повышение экспрессии NCAM120 и NCAM140 глиальными клетками при ишемии мозга наблюдали на 2–4-й день после повреждения [7]. Такое временное возрастание астроглиальной реакции на повреждение может быть важным молекулярным механизмом в последовательности событий, лежащих в основе нейрональной пластичности ЦНС взрослого человека. Ишемия мозга, вызванная нарушением кровотока, инициирует последовательность событий, ведущих к гибели клеток и дисфункции нервной системы. При этом деструкция глиальных клеток более выражена, чем нейрональных [7]. При временном нарушении кровотока в центральной артерии мозга также происходят быстрые изменения в экспрессии NCAM. Уже спустя 90 мин обнаруживается более интенсивное анти-NCAM иммуногистохимическое окрашивание коры головного мозга. Эти изменения наблюдаются на протяжении от одного до трех дней [11]. В локально поврежденных ишемических участках мозга проходит процесс репарации, который включает три этапа: пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток [11]. Предлагается использовать в качестве маркеров миграции адгезивные белки (в частности NCAM) и цитоскелетный белок промежуточных филаментов астроцитов GFAP [7].

Экспрессия МКА регулируется значительным количеством факторов: нейротрансмиттерами, рядом гормонов и трофических факторов, уровнем внутриклеточной концентрации Са2+ и Na+, а также наличием экстрацеллюлярного матрикса [5]. Например, дисрегуляция NCAM ассоциируется с синаптическими нарушениями, которые лежат в основе передачи сигналов между отдельными областями мозга, а также последующим нарушением функций нервной системы. Приведенные данные о NCAM/CD56 позволяют предположить возможную роль этого антигена в патогенезе АГ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об ассоциации изменений в уровне МКА NCAM/CD56 в мембранной фракции лимфоцитов с поражением ЦНС при ГБ. По нашему мнению, изучение NCAM/CD56 перспективно в качестве вероятного прогностического маркера клинического варианта течения заболевания.

Выводы

1. У пациентов с гипертонической болезнью наблюдается повышение содержания NCAM/CD56 в мембранной фракции лимфоцитов по сравнению с практически здоровыми лицами без отягощенного анамнеза.
2. При гипертонической болезни II стадии наибольший уровень NCAM/CD56 обнаружен у пациентов с дисциркуляторной энцефалопатией, подтвержденной результатами магнитно-резонансной томографии головного мозга.

1. Свищенко Е.П., Коваленко В.Н. Артериальная гипертензия. – К.: Морион, 2001. – 526 с.
2. Шепелева И.И., Чехонин В.П. Нейрональные молекулы клеточной адгезии (структура, функции, клинико-диагностические перспективы) // Журн. невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 1996. – № 5. – С. 113-117.
3. American Heart Association. Heart and stroke facts // Statistics 1997 (statistical supplement). – Dallas: American Heart Association, 1997. – 110 p.
4. Baydas G., Nedzvetsky V.S., Nerush P.A., Kirichenko S.V. A novel role for melatonin: regulation of the expression of cell adhesion molecules in the rat hippocampus and cortex // Neurosci. Lett. – 2002. – Vol. 326, № 2. – P. 109-112.
5. Berezin V., Bock E., Poulsen F.M. The neural cell adhesion molecule // Current Opinion in Drug Discovery & Development. – 2000. – Vol. 3. – P. 605-609.
6. Di Bona E., Sartоri R., Zambello M. et al. Prognostic significance of CD56 antigen expression in acute myeloid leukemia // Haematologica. – 2002. – Vol. 41, № 1. – P. 34-38.
7. Fox G.B., Kjoller C., Murphy K.J., Regan C.M. The modulations of NCAM polysialylation state that follow transient global ishemia are brief on neurons but enduring on glia // J. Neuropathol. Exp. Neurology. – 2001. – Vol. 60, № 2. – P. 132-140.
8. Hashiguchi T., Tara M., Niina K. et al. Adult T-cell leukemia cells which express neural cell adhesion molecule (NCAM) and infiltrate into the central nervous system // Intern. Med. – 2002. – Vol. 41, № 1. – P. 34-38.
9. Hoffmeister H.M., Kozmaier S. Activation of inflammatory pathways in acute coronary syndromes // Europ. Heart J. – 2000. – Vol. 21. – P. 650-656.
10. Jucker M., Mondadori C., Mohajeri H. et al. Transient upregulation of NCAM mRNA in astrocytes in response to enthothinal cortex lesions and ishemia // Mol. Brain. Res. – 1995. – Vol. 28, № 1. – P. 149-156.
11. Iwai M., Sato K., Omori N. et al. Three steps of neural stem cells development in gerbil dentate gyrus after transient ischemia // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 2002. – Vol. 22, № 4. – P. 411-419.
12. Karkela J., Bock E., Kaukinen S. CSF and serum brain-specific creatine kinase isoenzime (CK-BB), neuron-specific enolase (NSE) and neural cell adhesion molecule (NCAM) as prognostic markers for hypocsic brain injury after cardiac arrest in man // J. Neurol. Sci. – 1993. – Vol. 116, № 1. – P. 100-109.
13. Laemmli O.H. Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 1. – P. 243-246.
14. Lanier L.I., Chang C., Azuma M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56) // J. Immunol. – 1991. – Vol. 146. – P. 4421-4426.
15. Li H., Gybulsky M.I., Gimbrone M.A.Jr., Libby P. An atherogenic diet rapidly incuces VCAM-1, a cytokine-regulatable mononuclear leukocyte adhesion molecule, in rabbit aortic endothelium// Arterioscler. Thromb. – 1993. – Vol. 13. – P. 197-204.
16. Miller G.L. Protein determination for large numbers of samples // Anal. Chem. – 1959. – Vol. 31, № 5. – P. 964-966.
17. Stokes J., Kannel W.B., Wolf P.A. Blood pressure as a risk factor for cardiovascular disease. The Framingham study – 30 years of follow-up // Hypertension. – 1989. – Vol. 13. – P. 113-118.
18. Swales J., De Bono D. Cardiovascular risk factors. – London; N. Y.: Gower Medical Publ, 1993. – 183 p.

Essential hypertension and content of cellular adhesion protein NCAM/CD56 in membranes of the lymphocytes

А.V. Kuryata, V.S. Nedzvetsky, S.V. Кirichenko, Yu.V. Yegorova

The purpose of an examination was to estimate the changes of neurospecific protein of cell adhesion NCAM/CD56 in lymphocyte membranes of the patients with essential hypertension (EH) with various variants of course of the disease. 28 patients with EH of II and III stages in the age of 46–73 years were distributed into four groups depending on the character and degree of target organs damage. The first group included patients with EH of II stage and phenomena of dyscirculatory encephalopathy (DEP), second group – patients with hypertrophy of left ventricle (LV), third and fourth groups – patients with EH of III stage and previous cerebral stroke and myocardial infarction, accordingly. The diagnosis of EH was verified by the generally accepted tests. Echocardiography and magnetic resonance tomography were carried out. The content of NCAM/CD56 in membranous fraction of lymphocytes was performed by immunobloting with a monospecific rabbit antiserum.

The results showed that NCAM/CD56 content was increased in membranous fraction of lymphocytes in patients with hypertension, in comparison with practically healthy persons. The greatest level was registered in group of patients with hypertension of II stages with manifestations of DEP. Difference of NCAM/CD56 index between groups of patients with predominance of CNS damage (DEP, stroke) and structural changes of myocardium (hypertrophy of LV, myocardial infarction) confirm the priority role of cerebral changes. The further investigation of NCAM/CD56 in cell membrane fraction of patients with hypertension may become a useful prognostic marker of disease development.