Ключевые слова: дилатационная кардиомиопатия, тропонин, актомиозин, антитела, АТФазная активность

Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) – заболевание миокарда, которое является одной из главных причин развития дисфункции миокарда, тяжелой сердечной недостаточности. ДКМП значительно чаще, чем другие заболевания сердечно-сосудистой системы, приводит к необходимости трансплантации сердца [18]. До настоящего времени патогенетические механизмы ДКМП окончательно не ясны. Широкое распространение получила вирусо-иммунологическая теория развития заболевания, согласно которой одним из ведущих патогенетических механизмов формирования ДКМП является развитие аутоиммунных реакций [3, 5, 10, 11, 15, 22, 24]. Список аутоантител (АТ), выявленных при ДКМП, достаточно большой, постоянно расширяется и включает аутоантитела к митохондриальному адениннуклеотидному транслокатору [15], b-адренорецепторам [10], ламинину [24], к сарколеммной Na+/K+-ATФазе [3], шаперонам [11]. На сегодняшний день уже доказано функциональное влияние и патогенетическое значение некоторых аутоантител при ДКМП [8, 20]. В современных исследованиях изучали иммунные реакции на различные структурные белки миофибриллы и цитоскелет кардиомиоцита, однако основное внимание уделяли кардиальному миозину [5, 22]. В то же время регуляторное звено саркомера (тропомиозин-тропониновый комплекс) остается недостаточно изученным.

Цель исследования – изучить иммунный ответ на кардиальный тропонин и исследовать функциональное влияние АТ на АТФазную активность чувствительного к кальцию актомиозина (АМ) при ДКМП.

Материал и методы

В работе исследована сыворотка 62 больных с ДКМП и 21 здорового донора. Выделение препаратов тропонинового комплекса проводили по методу Н.Б. Барской и Н.Б. Гусева [1]. Препараты тропонинового комплекса выделяли из секционного материала желудочков 3 больных с ДКМП и практически здорового человека, умершего вследствие несчастного случая. Чистоту полученных белковых препаратов определяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях по методу U. Laemmli [7]. Концентрацию белков определяли по методу M. Bradford [4]. Уровень циркулирующих АТ к тропонину определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) [13]. Поликлональные АТ (IgG) выделяли из сыворотки больных с ДКМП (АТд) и здоровых доноров (АТн) методами ионообменной (носитель – DEAE-сефароза) и аффинной хроматографии (носитель Protein-G сефароза) по методу, описанному нами ранее [21]. На последнем этапе АТд и АТн очищали на аффинной колонке с пришитым тропониновым комплексом. АМ, чувствительный к ионам кальция (то есть содержащий тропомиозин-тропониновое звено), выделяли из миокарда быка по методу S. Margossian [12]. Биологическую активность АТ определяли по их возможному модифицирующему воздействию на тропонины в реакции энзиматической (АТФазной) активности чувствительного к кальцию АМ. Перед постановкой реакции препарат тропонина преинкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин с различными концентрациями АТд и АТн. В качестве контроля использовали препарат тропонина без антител.
АТФазную активность АМ оценивали по количеству отщепленного неорганического фосфата, который определяли по методу C. Fiske и Y. Subbarow [6]. Cтатистическую обработку результатов проводили c использованием пакета статистических программ “Statistica for Windows 5.0” с использованием t-критерия Стьюдента. Значения P<0,05 рассматривали как критерий достоверности различий.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследования уровня АТ к препаратам тропониновых комплексов представлены на рис. 1. Определение уровня АТ с помощью метода ELISA показало, что их титры достоверно (Р<0,05) выше в сыворотке у пациентов с ДКМП, чем в группе здоровых доноров. При этом в сыворотке у больных зафиксирован наиболее высокий уровень АТ к препарату тропонинового комплекса, выделенному из миокарда пациентов с ДКМП.

Рис. 1. Иммунореактивность сыворотки (определенная в реакции ELISA) у здоровых доноров (ЗД) и больных с ДКМП (ДКМП) на кардиальный тропонин, выделенный из нормального (тропонин нормальный) и дилатационного (тропонин ДКМП) миокардов человека.

Для изучения возможного функционального влияния АТ проводили исследование их влияния на АТФазную активность АМ, чувствительного к ионам кальция. Результаты данного фрагмента исследований показали, что только АТд увеличивают АТФазную активность АМ в кальциевой среде (рис. 2). АТн практически не влияли на активность исследуемого фермента. При этом АТд оказывали дозозависимое активирующее влияние на АТФазную активность АМ. Для контроля наличия каталически активных антител в инкубационную смесь для постановки АТФазной реакции предварительно вносили только АТ, аффинно очищенные из сыворотки, наиболее иммунореактивных к тропониновому комплексу. Полученные результаты свидетельствовали о том, что ни АТд, ни АТн не проявляют тропониноподобную каталитическую активность, способную влиять на ферментативную активность АМ.

Рис. 2. Влияние АТн и АТд на АТФазную активность чувствительного к кальцию АМ в кальциевой (Са) и безкальциевой (ЕГТА) среде: 1 – без добавления АТ; 2, 3, 4 – с добавлением 10, 15 и 25 мкг АТн; 5, 6, 7 – с добавлением соответственно 10, 15 и 25 мкг АТд.

У части больных с ДКМП доказана функциональная и патогенетическая роль некоторых АТ. По данным литературы, ухудшение сократительной способности миофибрилл при ДКМП может быть вызвано АТ-опосредованным изменением функционирования кальциевых каналов внешней мембраны кардиомиоцитов. H.P. Schulheiss и соавторы продемонстрировали способность АТ против митохондриального адениннуклеотидного транслокатора перекрестно реагировать с детерминантами кальциевых каналов поверхностной мембраны кардиомиоцитов [14, 21]. Последнее приводило к усилению притока кальция, кальциевой перегрузке и гибели клетки. Показано также, что анти-b1-адренорецепторные антитела больных оказывают положительный хронотропный эффект на неонатальные кардиомиоциты крыс in vitro [23]. В клинических исследованиях было показано, что удаление анти-b1-адренорецепторных иммуноглобулинов методом иммуноадсорбции способствовало улучшению функционального состояния больных и показателей функционирования сердечно-сосудистой системы при ДКМП [16]. C.J. Limas и соавторы доказали, что анти-b1-адренорецепторные антитела, выделенные из сыворотки у больных с ДКМП, способны взаимодействовать с b-адренорецепторами и ингибировать аденилатциклазную активность в кардиомиоцитах [9]. При этом роль белков регуляторного комплекса и их иммуногенности при ДКМП оставалась практически неизученной.

Полученные нами данные, а также результаты исследований, опубликованные нами ранее, позволяют говорить, что при ДКМП иммуногенность тропонина повышается [2]. При этом выявлено, что АТд оказывают активирующее влияние на АТФазную активность АМ, и данный эффект является дозозависимым. Чем больше концентрация АТ, тем выше АТФазная активность АМ. Интерпретировать полученные данные достаточно сложно. Наиболее интересным представляется объяснение, что изменение АТФазной активности АМ под влиянием АТд может быть одним из компенсаторных адаптационных механизмов, которые формируются в ответ на снижение сократительной способности миокарда при ДКМП. Можно предположить, что активирующее влияние АТд опосредовано их взаимодействием со своими эпитопами на антигене-мишени, в результате чего последний изменяет свою конформацию. Вполне логично, что предполагаемые конформационные изменения могут быть одной из причин повышения скорости кальциевого обмена, и как следствие – активации АТФазы АМ.

Не вызывает сомнений и тот факт, что иммуноглобулины способны проникать не только через цитоплазматическую мембрану клеток, но и в ядро. Такие данные получены как на культуре клеток, так и in vivo [17, 19]. На сегодняшний день нет прямых доказательств того, что АТд или другие АТ проникают в кардиомиоциты при ДКМП. Однако доказанная возможность проникновения иммуноглобулинов через цитоплазматическую мембрану указывает на необходимость проведения исследований в этом направлении. При ДКМП имеет место значительное снижение сократительной способности миокарда [18], и было бы некорректно отбрасывать возможность проникновения АТд внутрь кардиомиоцита. В этом случае можно предположить, что если АТд действительно способны попадать внутрь кардиомиоцитов in vivo, то нельзя исключать, что они будут взаимодействовать с миофиламентами и способствовать повышению сократимости миофибриллы.

Выводы

1. У больных с ДКМП уровень аутоантител к кардиальному тропонину достоверно выше, чем у здоровых доноров.
2. Преинкубация тропонина с аффинно очищенными АТд оказывает дозозависимый активирующий эффект на ферментативную (АТФазную) активность актомиозина, чувствительного к ионам кальция, в кальциевой среде.

1. Барская Н.Б., Гусев Н.Б. Тропонин сердца быка: выделение и изучение катионсвязывающих свойств с помощью флюоресцентного зонда диметиламинонафтэйродина // Биохимия. – 1981. – Т. 46. – С. 495-503.
2. Сидорик Л.Л., Федоркова О.М., Рябенко Д.В. и др. Сравнительное исследование иммунореактивности тропонинового комплекса при дилатационной и ишемической кардиомиопатиях // Биополимеры и клетка. – 2001. – Т. 16, №1. – С. 40-45.
3. Baba A., Yoshikawa T., Mitamura H. et al. Autoantibodies against sarcolemmal Na-K-ATPase in patients with dilated cardiomyopathy: autoimmune basis for ventricular arrhythmia in patients with congestive heart failure // J. Cardiolоgy. – 2002. – Vol. 39. – P. 50-51.
4. Bradford M. A rapid and sensitive method for quantitation and microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein binding // Ann. Biochem. – 1976. – Vol. 46. – P. 193-200.
5. Caforio A., Mahon N., Mckenna W. Cardiac autoantibodies to myosin and other heart-specific autoantigenes in myocarditis and dilated cardiomyopathy // Autoimmunity. – 2001. – Vol. 34. – P. 199-204.
6. Fiske C., Subbarow Y. The colorimetric determination of phosphorus // J. Biol. Chem. – 1925. – Vol. 66. – P. 375-400.
7. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 52. – Р. 680-685.
8. Limas C.J., Goldenberg I., Limas C. Autoantibodies against b-adrenoreceptors in human idiopathic dilated cardiomyopathy // Circ. Res. – 1989. – Vol. 64. – P. 97-103.
9. Limas C.J., Goldenberg I., Limas C. Effect of antireceptor antibodies in dilated cardiomyopathy on the cycling of cardiac beta receptors // Amer. Heart J. – 1991. – Vol. 122. – P. 108-114.
10. Limas C.J., Limas C., Kubo S., Olivari M. Anti-b-receptor antibodies in human dilated cardiomyopathy and correlation with HLA-DR antigenes // Amer. J. Cardiology. – 1990. – Vol. 65. – P. 483-487.
11. Mandi Y., Hogye M., Talha E. et al. Cytokine production and antibodies against heat shock protein 60 in cardiomyopathies of different origins // Pathobiology. – 2000. – Vol. 69. – P. 150-158.
12. Margossian S. Reversible dissotiation of dog cardiac myosin regulatory light chain 2 and its influence on ATP hydrolysis // J. Biol. Chem. – 1985. – Vol. 260.– P. 13747-13754.
13. Matsiota P., Druet P., Dasquet P. Natural autoantibodies in systemic lupus erythematosis // Clin. Exp. Immunology. – 1987. – Vol. 69. – P. 79-88.
14. Meyer M., Schillinger W., Pieske B. et al. Alteration of sarcoplasmic reticulum proteins in failing human dilated cardiomyopathy // Circulation. – 1995. – Vol. 92. – P. 778-784.
15. Morad M., Davies N., Ulrich G., Schultheiss H.P. Autoantibodies against ADP-ATP carrier enchance Ca2+ current in isolated cardiac myocytes // Amer. J. Physiology. – 1988. – Vol. 255. – P. 960-964.
16. Muller J., Wallukat G., Dander M. et al. Immunoglobulin adsorption in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy // Circulation. – 2000. – Vol. 101. – P. 385-391.
17. Portales-Perez D., Alarcon-Segovia D., Llorente L. et al. Penetrating anti-DNA monoclonal antibodies induce activation of human peripheral blood mononuclear cells // J. Autoimmun. – 1998. – Vol. 11, № 5. – P. 563-571.
18. Report of 1995 WHO/ISFC, Task force on the definition and classification of cardiomyopathies // Circulation. – 1996. – Vol. 93. – P. 841-842.
19. Ruiz-Arguelles A., Perez-Romano B., Llorente L. et al. Penetration of anti-DNA antibodies into immature live cells // J. Autoimmun. – 1998. – Vol. 11, № 5. – P. 547-556.
20. Schulze K., Heineman F., Schultheiss H.P., Balaban R. Impairment of myocardial calcium homeostasis by antibodies against the adenine nucleotide translocator // Cell. Calcium. – 1999. – Vol. 25. – P. 361-370.
21. Sidorik L., Gudzera O., Dragovoz V. et al. Immuno-chemical non-cross-reactivity between eukaryotic and procaryotic seryl-tRNA synthetases // FEBS. – 1991. – Vol. 292. – P. 76-78.
22. Sidorik L., Rodnin N., Bobyk V. et al. Investigation of autoan tibodies directed against tissue-specific myocardial antigenes at dilated cardiomyopathy // Biopolimers and Cell. – 1995. – Vol. 11, № 1. – P. 81-87.
23. Wallukat G., Wollenberger A., Morwinski R., Pischner H.-F. Anti-b1-adrenoreceptor autoantibodies with chronotropic activity from the serum of patients with dilated cardiomyopathy: mapping of epitopes in the first and second extracellular loops // J. Mol. Cell. Cardiology. – 1995. – Vol. 27. – P. 397-406.
24. Wolff P., Kuhl U., Schultheiss H.P. Laminin distribution and autoantibodies to laminin in dialted cardiomyopathy and myocarditis // Amer. Heart J. – 1989. – Vol. 117. – P. 1303-1309.

Investigation of immune reactions to cardiac troponin and biological activity of antibodies in patients with dilated cardiomyopathy

V.N. Kovalenko, O.M. Fedorkova, V.I. Bobyk, L.L. Sidorik, D.V. Ryabenko, G.Kh. Matsuka

Pathogenetic mechanisms of dilated cardiomyopathy (DCM) are not clear yet. The virus-immunological theory that assumes the evolution of autoimmune reactions as one of the main mechanisms of disease development and progression is widespread. The aim of investigation was to study the immune response to cardiac troponin in dilated cardiomyopathy (DCM) and functional influence of anti-troponin antibodies on АТPase activity of actomyosin sensitive to calcium. Sera of 62 DCM patients and 21 healthy donors were examined. Isolation of troponin complex was carried out from a section material of ventricular myocardium of DCM patients and practically healthy person who died at accident. Polyclonal antibodies (IgG) from sera of patients with DCM and healthy donors were allocated by ion-exchanging and affine chromatography methods. Actomyosin ATPase activity was estimated by the quantity of chip off inorganic phosphate. Level of circulating anti-troponin antibodies was determined by ELISA method. Biological activity of antibodies was measured on their possibility to modify the ATPase activity of actomyosin that was sensitive to calcium. It was found that at DCM there is a significant increase of level of antibodies to cardiac troponin in DCM patients’ sera. It was revealed, that affinly purified antibodies from DCM patients’ sera render activating influence on ATPase activity of actomyosin. Results of the carried out research have shown, that this functional influence of antibodies was dose-dependent.