КЛЮЧОВІ СЛОВА: холестерин, нітрит-аніон, нітрат-аніон, ішемічна хвороба серця, есенціальна гіпертензія, еритроцити

У новітніх теоріях патогенез есенціальної гіпертензії (ЕГ) та ішемічної хвороби серця (ІХС) розглядають з точки зору патологічних змін у мембранах кардіоміоцитів, пов’язаних з окисною модифікацією ліпідних та білкових компонентів під впливом підвищеного рівня циркулюючого холестерину (ХС).

Раніше нами було встановлено, що порушення обміну у пацієнтів з ІХС та ЕГ зумовлені змінами метаболізму L-аргініну, здійснюваному двома альтернативними шляхами – окисним NO-синтазним (з генерацією оксиду азоту – NO) та неокисним аргіназним (з утворенням карбаміду та орнітину – субстрату для синтезу поліамінів). В експерименті при інфаркті міокарда у собак [13] та при ЕГ у спонтанно гіпертензивних щурів (SHR) [4] спостерігали активацію неокисного шляху (підвищення рівнів циркулюючих карбаміду та поліамінів) і, як наслідок, інгібування окисного шляху метаболізму L-аргініну (зниження рівнів циркулюючих стабільних метаболітів NO та активності NO-синтази – NOS).

Важлива роль у механізмах стресорного та ішемічного пошкодження біомембран кардіоміоцитів і ендотеліоцитів належить активації фосфоліпаз, гідролізуючих гліцеро- та сфінгофосфоліпіди, такі як фосфоліпази А2, С, D, сфінгомієлінази, а також, як встановлено нами [2], ліпаз, що гідролізують нейтральні ліпіди, в тому числі ефіри ХС. Під час гідролізу ліпаз холестеринестеразою вивільняється ХС, який може виконувати регуляторну функцію [2]. В нормальних та патологічних умовах останню вивчали багато дослідників [7, 11]. Встановлено, що ХС разом із сфінгомієліном є одним з основних компонентів ліпідних мікродоменів (rafts) мембран [15], локалізованих у так званих кавеолах, в яких переважно і зосереджені вищевказані гліцеро- і сфінгофосфоліпази, а також інші важливі ферменти – компоненти різних систем сигнальної трансдукції, в тому числі і NOS. Встановлено наявність кавеол у плазматичних мембранах ендотеліоцитів судин [14] і виявлено, що фактично вся активність ендотеліальної ізоформи NOS (еNOS) локалізована саме в цих мембранних структурах, збагачених ХС. Згідно з даними літератури у хворих з ЕГ із синдромом гіперхолестеринемії активність NOS підвищується, тоді як на більш пізніх стадіях, навпаки, знижується. Розвиток атеросклерозу супроводжується зміною активності NOS: у ранній період активність NOS знижується, у хронічній фазі – підвищується [17].

На даний час NO розглядають як один з найбільш важливих регуляторів тиску крові завдяки його здатності знижувати підвищений рівень кальцію в цитозолі у хворих з ЕГ. Враховуючи наявність зв’язку між рівнями ХС і NO, питання про негативну дію ХС як фактора ризику слід розглядати в аспекті можливої ролі цього стеролу в регуляції синтезу NO у клітинах серцево-судинної системи (тобто в еритроцитах, кардіоміоцитах і ендотеліоцитах).

Метою роботи було дослідити зв’язок між рівнями циркулюючого ХС та продуктами окисного та неокисного обміну L-аргініну – стабільними метаболітами NO і карбамідом, а також зв’язок між рівнем ХС та активністю аргінази в еритроцитах пацієнтів з ЕГ, ІХС, ІХС у поєднанні з ЕГ.

Матеріал і методи

У дослідженні брали участь 60 пацієнтів, яких було розподілено на 3 основні групи: I – 15 пацієнтів зЕГ, II – 15 пацієнтів з ІХС, III – 15 пацієнтів з ІХС та ЕГ, а також 15 практично здорових донорів. Усі основні групи пацієнтів залежно від рівня ХС було розподілено на 2 підгрупи – пацієнти з нормохолестеринемією (НХС) і гіперхолестеринемією (ГХС). В усіх групах переважали чоловіки. Кров для дослідів відбирали з ліктьової вени зранку натще (через 12 год після останнього прийому їжі). Досліджено вміст карбаміду та стабільних метаболітів NO – нітрит-аніонів (NO-2) та нітрат-аніонів (NO-3), а також визначено активність аргінази в еритроцитах у 47 осіб з різним вмістом (високим і нормальним) ХС.

Діагноз ІХС та ЕГ у пацієнтів встановлювали з урахуванням результатів клініко-лабораторних та інструментальних методів дослідження (відповідно до критеріїв ВООЗ).

Вміст загального ХС у плазмі крові визначали кількісним методом за допомогою аналізатора “Сobas Fara” (Австрія).

Вміст NO-2 у еритроцитах визначали високоспецифічним спектрофотометричним методом Гріна [9] за даними кольорової реакції з реактивом Гріса, вміст NO-3 – за допомогою бруцинового реактиву [6]. Активність аргінази визначали за утворенням карбаміду [8], а останній – за допомогою набору реактивів фірми “Laсhema” (Словакія). Еритроцити виділяли стандартним методом центрифугування з подальшим триразовим відмиванням їх ізотонічним розчином. Вміст досліджуваних показників розраховували на 1 мг загального білка (визначали за допомогою методу Бредфорда) і обробляли статистично з використанням критерію Стьюдента.

Результати та їх обговорення

Отримано результати дослідження інтенсивності окисного (NO-синтазного) та неокисного (аргіназного) шляхів метаболізму L-аргініну в еритроцитах залежно від рівня ХС у плазмі крові та рівня артеріального тиску (табл. 1, 2). Раніше були опубліковані наші дані щодо вмісту стабільних метаболітів NO та карбаміду в плазмі крові, активності в ній NOS та аргінази у хворих з ЕГ [1]. Таким чином, дані, наведені нижче, є продовженням попередніх досліджень.

Таблиця 1 Вміст стабільних метаболітів NO в еритроцитах залежно від вмісту загального холестерину в плазмі крові в обстежених пацієнтів

Примітка. Різниця показників достовірна порівняно з такими: * – у здорових осіб; ° – при нормохолестеринемії (P<0,05). Те саме у табл. 2.

Таблиця 2 Активність неокисного метаболізму L-аргініну в еритроцитах залежно від вмісту загального холестерину в плазмі крові обстежених пацієнтів

Так, у групі I достовірне підвищення рівня NO-2 в еритроцитах порівняно з таким у здорових осіб не залежить від рівня ХС у плазмі. Рівень NO-3 в еритроцитах, навпаки, достовірно знижується порівняно з таким у здорових осіб лише при НХС. Активність аргінази в еритроцитах у групі I зростає лише при НХС, тоді як вміст карбаміду, що є продуктом цієї реакції, достовірно підвищується як при НХС, так і при ГХС.

У пацієнтів з ІХС (група II) також значно змінюються показники окисного та неокисного шляхівметаболізму NO в еритроцитах порівняно з нормою. У групі II, як і в групі I, але більшою мірою, рівень NO-2 в еритроцитах підвищується незалежно від рівня ХС у плазмі порівняно з таким у здорових осіб. У групі II рівень NO-3 в еритроцитах був достовірно знижений на фоні ГХС і практично на рівні такого у здорових осіб при НХС. Рівень карбаміду у групі II достовірно зростав порівняно з таким у здорових осіб лише у пацієнтів з ГХС, тоді як у групі I він був достовірно вищим як при НХС, так і при ГХС, тобто незалежно від рівня ХС у плазмі. Активність аргінази у хворих з ІХС в еритроцитах була достовірно вищою порівняно з такою у здорових осіб незалежно від рівня ХС.

У групі пацієнтів з ІХС у поєднанні з ЕГ (група III) виявлено такі зміни: достовірно підвищувався рівень NO-2 в еритроцитах незалежно від рівня ХС, як і у групах I і II. У цих хворих незалежно від рівня ХС вміст NO-3 в еритроцитах не змінювався, на відміну від такого у здорових осіб. Рівень карбаміду у групі III при ГХС був достовірно нижчий, ніж угрупі здорових осіб та хворих з НХС, що значно відрізняється від змін рівня карбаміду в еритроцитах у хворих груп I і II. Так, при порівнянні зі здоровими особами у хворих з ЕГ (група I) рівень карбаміду в еритроцитах достовірно підвищувався як при НХС, так і при ГХС, тоді як у хворих групи III, навпаки, знижувався при ГХС або зовсім не змінювався при НХС. У групах II і III теж спостерігали такі зміни рівня карбаміду: при НХС у плазмі рівень карбаміду в еритроцитах не змінювався в обох групах хворих, тоді як при ГХС – підвищувався у групі II і, навпаки, знижувався у групі III. У хворих груп II і III виявлено меншу залежність активності аргінази від рівня ХС у плазмі. Ми спостерігали лише достовірне зростання активності аргінази у групі I при НХС, тоді як у хворих з ІХС і ЕГ (група III) активність аргінази не залежала від рівня ХС у плазмі крові.

Отже, можна зробити висновок, що вміст у крові продуктів обміну L-аргініну як шляхом окиснення NO-синтази (NO-2 і NO-3 ), так і неокисним аргіназним шляхом (карбамід) змінювався залежно від рівня ХС.

Параметри, які характеризують інтенсивність альтернативних шляхів метаболізму L-аргініну в еритроцитах, суттєво змінюються залежно від вмісту ХС, що передбачає можливість їх використання з метою діагностики. У наш час існує потреба у застосуванні біохімічних маркерів, які б допомагали диференціювати такі патологічні стани, як ЕГ, ІХС та їх поєднання. Ми пропонуємо для цього такі біохімічні маркери, як вміст стабільних метаболітів NO (NO-2 і NO-3), що є продуктами окисного метаболізму L-аргініну, а також вміст карбаміду в еритроцитах, що є продуктом альтернативного неокисного метаболізму L-аргініну.

З огляду на наявність активного обміну ХС між плазматичними мембранами еритроцитів та ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ) плазми крові [3], зміна інтенсивності метаболізму NO двома альтернативними шляхами (особливо окисного в NO-синтазній реакції) залежить від рівня ХС в оточуючому NOS ліпідному матриксі (ХС-сфінгомієлінові мікродомени (rafts), локалізовані в спеціалізованих компартментах плазматичної мембрани, так званих кавеолах) [15]. Дані щодо вмісту NO-2 і NO-3 частково відображають стан активності еNOS.

Відомо [15], що еNOS, наявна в еритроцитах у неактивному стані, активуючись, переміщується в кавеоли, в яких взаємодіє з білком кавеоліном-І. Цей процес є ліпідозалежним, зумовленим рівнем ацилювання ферменту жирними кислотами (С14-0, С18-0) та рівнем ХС у кавеолах. Регуляція активності еNOS кавеоліном є біологічно важливим процесом, оскільки ГХС обмежує генерацію NO за рахунок індукції синтезу кавеоліну [17]. Таким чином, зниження рівнів NO-2 і NO-3 у пацієнтів з ІХС при НХС і їх незмінені рівні при ГХС у плазмі крові можна пояснити можливим підвищенням рівня кавеолярного ХС (за рахунок переходу ХС з ЛПВЩ безпосередньо в кавеоли [5, 16]), що зумовлює утворення комплексу еNOS – кавеолін-І і тим самим інактивує фермент.

Добре відомо [12], що вміст ХС в еритроцитарній мембрані є фактором регуляції фізико-хімічних властивостей еритроцитів, а також активності багатьох еритроцитарних мембранозв’язаних ферментів і процесів транспорту іонів, у тому числі іонів кальцію та аніонів. Мембрани еритроцитів використовують як моделі для дослідження обміну між ліпопротеїдами і мембранами клітин за різних патологічних станів [10]. З відкриттям кавеол, що містять холестеринові мікродомени, в яких локалізовані переважно всі елементи систем сигнальної трансдукції (сполучені з G-білками рецептори, фосфоліпази, протеїнкінази [15]), стає зрозумілим широкий спектр регуляторної дії ХС, який зумовлює регуляцію трансдукції різних сигналів у клітину. Наявність кавеол в еритроцитах передбачає можливість прямого обміну ХС між ЛПВЩ та кавеолами (ХС безпосередньо зв’язується з кавеолінами) і тим самим пояснює зміну багатьох процесів у клітині при різних рівнях ХС у плазмі крові. Якщо це так, то очевидно, що меншою мірою “негативний” – атерогенний ХС ліпопротеїдів низької щільності (ХС ЛПНЩ), а більшою мірою “позитивний” – антиатерогенний ХС ЛПВЩ, може регулювати синтез такого важливого вазодилататора, як NO. Причому, більш високі рівні ХС ЛПВЩ можуть зумовлювати зниження рівня ХС в еритроцитарних кавеолах і тим самим підвищувати активність еNOS. У всіх обстежених нами пацієнтів відзначено підвищення рівня ХС ЛПНЩ і, навпаки, зниження вмісту ХС ЛПВЩ порівняно зі здоровими особами. Це може зумовлювати зміни рівня ХС в еритроцитарних кавеолах і бути однією з причин тих змін вмісту стабільних метаболітів NO, що ми спостерігали.

Висновки

1. При порівнянні з групою здорових осіб у пацієнтів всіх досліджених груп рівні NO-2 в еритроцитах були підвищені незалежно від рівня холестерину у плазмі крові.
2. При порівнянні з групою здорових осіб рівні NO-3 в еритроцитах були достовірно знижені у пацієнтів з есенціальною гіпертензією і нормохолестеринемією і у пацієнтів з ішемічною хворобою серця і гіперхолестеринемією; рівні NO-3 в еритроцитах не змінювалися як при нормохолестеринемії, так і при гіперхолестеринемії у пацієнтів з ішемічною хворобою серця та есенціальною гіпертензією.
3. Рівні карбаміду в еритроцитах достовірно підвищені у пацієнтів з есенціальною гіпертензією незалежно від рівня холестерину в плазмі крові і упацієнтів з ішемічною хворобою серця при гіперхолестеринемії та, навпаки, достовірно знижені у пацієнтів з поєднанням ішемічної хвороби серця і есенціальної гіпертензії при гіперхолестеринемії.
4. Активність аргінази в еритроцитах достовірно підвищена у пацієнтів з есенціальною гіпертензією при нормохолестеринемії, а у пацієнтів з ішемічною хворобою серця не залежить від рівня холестерину в плазмі крові.

1. Коваленко В.Н., Гулая Н.М., Семикопная Т.В. и др. Нарушение функции эндотелия у пациентов с ишемической болезнью сердца в сочетании с артериальной гипертензией // Укр. кардіол. журн. – 2002. – № 3. – С. 5-8.
2. Коцюруба А.В., Буханевіч О.М., Мегедь О.Ф. та ін. Гідроліз нейтральних ліпідів (тригліцеридів та ефірів холестеролу) при активації фосфоліпідної сигнальної системи С27-стероїдними гормонами екдистероном та кальцітріолом // Тези VII Укр. біохім. з’їзду. – К., 1997. – Ч. 2. – С. 181-182.
3. Никифорова А.А. Акцепция холестерина из мембран эритроцитов подфракцией ЛПВП26 и роль ЛХАТ в этом процессе // Биохимия. – 1988. – T. 53, № 8. – С. 1334-1339.
4. Сагач В.Ф., Коцюруба А.В., Базилюк О.В. та ін. Інгібітори аргіназного шляху метаболізму L-аргініну як новий клас антигіпертензивних сполук: дія карбаміду на окисний метаболізм ліпідів і судинний тонус при артеріальной гіпертензії // Фізіол. журн. –2001. – Т. 47, № 5. – С. 3-11.
5. Феденков В.И., Леонова Т.Я., Шумская В.Г. и др. Состояние эритроцитарного механизма регулирования холестеринемии при атеросклерозе. Механизмы патологических реакций. – Томск, 1981. – С. 132-135.
6. Bank N.R., Aynedjian H.S. Role of EDRF (nitric oxide) in diabetic renal hyperfiltration // Kidney Int. – 1993. – Vol. 43. – P. 1306-1312.
7. Dahl J.C., Dahl C.E., Bloch K. Effect of cholesterol on macromolecular synthesis and fatty acid uptake by micoplasma capricolum // J. Biol. Chemistry. – 1981. – Vol. 256, № 1. – P. 87-91.
8. Hayakawa H., Raij. L. Relationship between hypercholesterolemia, endothelial dysfunction and hypertension // J. Hypertension. – 1999. – Vol. 17, № 5. – P. 611-619.
9. Green L.C., David A.W., Glogowski J. еt al. Analysis of nitrate, nitrit and [15N] nitrate in biological fluids // Anal. Biochemistry. – 1982. – Vol. 126, № 1. – Р. 131-138.
10. Kakis G., Kuksis A., Breckenridge W.C. Redistribution of cholesterol and b-sitosterol between intralipid and ret plasma lipoproteins and red blood cells in vitro // Biochem. and Cell Biology. – 1988. – Vol. 66, № 12. – P. 1312-1321.
11. Ley S.L., Krief S., Farnier C. et al. Cholesterol a cell size-dependent signs than regulates glucose metabolism and gene expression in adipocytes // J. Biol. Chemistry. – 2001. – Vol. 276, № 20. – P. 16904-16910.
12. Locher R., Neyes L., Stimpel M. et al. The cholesterol content of the human erythrocytes influences calcium influx through the channel // Biochem. and Biophys. Res. Comm. – 1984. – Vol. 124, № 3. – P. 822-829.
13. Moibenko A.A., Brovkovich V.M., Marchenko G.I. et al. Nitric oxide and miocardial ischemia // J. Mol. Cell. Cardiology. – 1999. – Vol. 31, № 6. – Р. 52.
14. Razani B., Engelman J.A., Wang X.B. et al. Caveolin-1 null mice are viable but show evidence of hyperproliferative and vascular abnormalities // J. Biol. Chemistry. – 2001. – Vol. 276, № 41. – P. 38121-38138.
15. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A. et al. Caveolins, liquid-ordered domains and signal transduction // Mol. and Cell. Biology. – 1999. – Vol. 19, № 11. – P. 7289-7304.
16. Tretjakovs P., Kalnins U., Dabina I. et al. Plasma HDL-cholesterol has an effect on nitric oxide production and arachidonic acid metabolism in the platelet membranes of coronary heart disease patients without LDL-hypercholesterolemia // Med. Sci. Monitoring. – 2000. – Vol. 6, № 3. – P. 507-511.
17. Yang Z., Wang S. Relationship between nitric oxide synthase, endothelin and the initiation of hypertension and atherosclerosis // Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao. – 1998. – Vol. 29, № 2. – P. 160-164.

Levels of circulating metabolites of oxidative and non-oxidative metabolism of L-arginine in patients with ischemic heart disease, essential hypertension and syndrome of hypercholesterolemia

V.M. Kovalenko, T.M. Kornienko, T.V. Semikopna, N.M. Gula, A.V. Kotsuruba, G.V. Kosyakova

Understanding of the questions of pathophysiology of atherosclerosis is an actual and debatable problem of contemporary cardiology. The aim of our study was to establish interrelationship between level of cholesterol in blood plasma and level of products of L-arginine metabolism (NO-2, NO-3, urea) and activity of arginase in the erythrocytes of patients with ischemic heart disease (IHD), essential hypertension (EH) and IHD associated with EH and normal (NCH) and high cholesterol level (HCH) in plasma. 60 subjects were divided into 3 groups: 1 –15 pts with EH, 2 –15 pts with IHD, 3 –15 pts with IHD and EH, as well as 15 healthy volunteers. Cholesterol level in blood plasma detected by quantitative method (“Cobas Fara”, Austria); NO-2 level was detected by method of Green, NO-3 – with brucine reagent. Activity of arginase was established by formation of urea. We revealed that NO-2 level in erythrocytes was increased in all groups of patients, independently of the total cholesterol level in plasma. NO-3 level in erythrocytes was decreased in patients with IHD and HCH and in patients with IH and NCH. Urea level in erythrocytes was increased in patients with IHD and HCH and also decreased in erythrocytes of patients with IHD associated with EH and HCH in plasma. So, the level of products of non-oxidative and oxidative L-arginine metabolism in erythrocytes depends on plasma cholesterol. This phenomenon may be useful for diagnostic purposes.