КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: хронический стресс, эндотелий, атерогенез

Повышение требований к адаптационным механизмам организма на современном этапе развития цивилизации при неоптимальных социальных и экологических условиях приводит к хроническому стрессу (ХС), который в экономически развитых и, соответственно, наиболее урбанизированных странах давно приобрел характер эпидемии [12]. Медицинская статистика свидетельствует о том, что основной причиной инвалидизации и смертности населения этих регионов были и остаются болезни системы кровообращения, прежде всего поражения сосудов головного мозга и ишемическая болезнь сердца, чаще всего обусловленные атеросклеротическими повреждениями стенки сосуда [6].

Идея о проатерогенных свойствах ХС не нова, его способность провоцировать атерогенез подтверждена экспериментально [8, 11]. Выполненные нами ранее исследования подтвердили потенцирующее влияние ХС на атерогенез [2]. Это определяется его дезорганизующим воздействием на белковый, углеводный и жировой обмены с мобилизацией жировых резервов адипоцитов в виде жирных кислот, частично утилизируемых различными тканями, частично трансформирующихся в печени в липопротеиды [5, 12]. Стресс стимулирует экспрессию целого ряда цитокинов и других гуморальных факторов, оксидантные процессы, обусловливая модификацию липопротеидных комплексов плазмы и цитомембран [8, 12, 13].

Первой мишенью для всех этих воздействий становятся форменные элементы крови и выстилающий сосуды эндотелий, дисфункция которого, по современным представлениям, является ключевым звеном атерогенеза [7]. Однако морфо-функциональные эквиваленты и сам факт дисфункции эндотелия, непосредственно обусловленной хронической стрессорной ситуацией, все еще остаются в сфере гипотез и предположений, что и определило основные цели и задачи данного исследования.

Материал и методы

Хронический эмоционально-болевой стресс (ХЭБС) воспроизводили на кролях, используя электроимпульсную модель [8], собственная модификация которой состояла в многократном пролонгированном (до 10 сут) воздействии на экспериментальное животное с произвольным варьированием продолжительности и его сеансов, и промежутков между ними. Основным объектом исследования был эндотелий аорты. Образцы ткани фиксировали в 4 % изотоническом забуференном растворе параформа, дофиксировали в 1 % растворе OsO4, обезвоживали и заключали в эпоксидные смолы по стандартной прописи. Ультратонкие срезы получали на приборе “LKB-8800” (“LKB”, Швеция), контрастировали солями тяжелых металлов и исследовали в электронном микроскопе “ПЭМ-125К” (“Selmi”, Украина). Наряду с рутинной трансмиссивной электронной микроскопией использовали цитохимические тесты на активность аденилатциклазы (АДЦ) [16], НАДФЧН-диафоразы [15], фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов (ФДЭ), моноаминоксидазы (МАО). Некомпенсированные отрицательные заряды сиаловых кислот и гликозаминогликанов гликокаликса эндотелиоцитов выявляли с помощью ферризоля [3]. Для визуализации элементов цитоскелета использовали тиокарбогидрозид [9].

Результаты и их обсуждение

Изменения гуморально-метаболического статуса организма сопровождались хорошо выраженной реакцией сосудистого эндотелия, морфо-функциональная гетерогенность клеток которого резко возрастала. Часто отмечали отек или дегидратацию цитоплазматического матрикса эндотелиоцитов со значительными колебаниями его электронной плотности, изменениями формы и объема клеток, явления микроклазматоза, различную степеньактивирования секреторно-пластических процессов, о чем свидетельствуют гипертрофия и гиперплазия элементов эндоплазматического ретикулума и пластинчатого комплекса Гольджи, окруженных многочисленными полиморфными везикулами и вакуолями (рис. 1).

Рис. 1. Компенсаторно-приспособительные изменения эндотелиоцитов при ХЭБС: а – усиление микроклазматоза (ув. 8500); б, в – гипертрофия и гиперплазия элементов гранулярного эндоплазматического ретикулума и пластинчатого комплекса Гольджи (ув. 11 000).

Вследствие перестройки метаболизма эндотелиоцитов с преимущественно углеводного обмена на преимущественно липидный, требующий более высоких энергозатрат, в их цитоплазме нередко накапливались липидные капли (рис. 2а). При истощении адаптивных возможностей клеток механизмы внутриклеточной регенерации ограничиваются. В митохондриях, которые на предыдущих этапах перестройки подвергались гиперплазии, регистрировали, как и в других органеллах, деструктивные изменения, что нарушает биоэнергетику клетки, снижает активность МАО и соответственно способность поврежденных эндотелиоцитов катаболизировать биогенные амины (рис. 2б, 2в).

Рис. 2.а – липидные включения в цитоплазме эндотелиоцита аорты с альтеративно измененными митохондриями
(ув. 14000); б – снижение активности МАО при ХЭБС; в – контроль (ув. 12 500).

В различной степени выраженная деформация увеличивала обменную поверхность эндотелиоцитов, укрепляя их связь со стенкой сосуда. Однако формирование массивных, иногда ядросодержащих выступов негативно влияло на пристеночный кровоток (рис. 3а, 3б).
   Рис. 3. Усложнение рельефа эндотелиоцитов аорты при ХЭБС: а – сложноконтурное выбухание плазмолеммы на базальной поверхности клетки; неравномерное распределение ферризоль-позитивных анионных групп гликокаликса на люминальной поверхности (ув. 16 000); б – ядросодержащий выступ в просвет сосуда (ув. 6500).

Это сочетается с повышением адгезивности стенки сосуда, обусловленным стресс-индуцированной перестройкой цитолеммы со снижением суммарной концентрации ферризоль-позитивных некомпенсированных анионных групп гликозаминогликанов и сиаловых кислот гликокаликса, распределение которых становилось неравномерным (см. рис. 3а). Его вещество подвергалось рарификации и диссоциации, а появление локусов обнажения плазмолеммы делало ее более доступной для неблагоприятных воздействий: активирующихся липаз, фосфолипаз, широкого спектра гуморальных факторов, одним из свидетельств чего являлась активация АДЦ (рис. 4а, 4б). При этом относительно меньшее активирование ФДЭ циклических нуклеотидов создает предпосылки для рецепторопосредованного накопления Са2+ во внутриклеточной среде (рис. 4в, 4г).
  Рис. 4. Изменения каталитической способности энзимов, функционально сопряженных с рецепторным аппаратом эндотелиоцитов: АДЦ (а – ХЭБС, б – контроль) и ФДЭ (в – ХЭБС, г – контроль) (ув. 14 000).

Стимулируемая стрессом оксидативная модификация изменяла физико-химические свойства, в частности пластичность плазмолеммы, которая не только образовывала микроворсины, выступы и втяжения, но и подвергалась микроконфигурационным изменениям, утрачивая четкость контуров и формируя миелиноподобные фигуры (рис. 5). В совокупности с перестройкой гликокаликса это уменьшает отрицательный потенциал клеточной поверхности, облегчая неопосредуемое рецепторами ассоциирование с ней липопротеидов плазмы и форменных элементов крови.

Рис. 5. Снижение четкости контуров и миелиноподобная трансформация плазмолеммы эндотелиоцита аорты при ХЭБС (ув. 11 500).

Возрастающая неоднородность клеток оказывала влияние на функции монослоя эндотелия какважнейшего компонента гистогематического барьера. Эндотелиоциты существенно различаются по степени везикуляции, интенсивности взаимодействия везикул с плазмолеммой, характеру их распределения в цитоплазме, часто очень неравномерного, с тенденцией к образованию более или менее значительных скоплений вдоль одной из поверхностей клетки либо в цитоплазматическом матриксе, что вместе со снижением активности АТФазы свидетельствует об ограничении эффективности массопереноса посредством микропиноцитоза (рис. 6).

  Рис. 6. а – неравномерное распределение варьирующих по объему микропиноцитозных везикул в цитоплазме эндотелиоцита (ув. 13 500); б – снижение АТФазной активности в эндотелиоците аорты при ХЭБС; в – контроль (ув. 18 000).

Специфическое контрастирование макропеноцитозных везикул (МПВ) при реакции на АТФазу позволяет дифференцировать различные субпопуляции МПВ: везикулы, не дающие положительной реакции, по-видимому, доставляют продукты внутриклеточного синтеза во вне либо являются мембранным резервом клетки, а интенсивно маркируемые осуществляют трансэндотелиальный перенос веществ и участвуют в определенных фазах их катаболизма, в том числе посредством создания необходимого для этого уровня рН во внутривезикулярной среде за счет АТФазной активности [4]. Липо- и протеинотропные эффекты стресса изменяют липидное микроокружение, конформационное состояние и тем самым функцию жизненно важных мембраносвязанных белков: рецепторов, ионных каналов, ассоциированных с мембраной ферментов, например АДЦ, АТФаз и NO-синтаз.

Изменения каталитической способности НАДФЧН-диафоразы, одного из обязательных компонентов NO-синтазной системы [9], имели несколько иную направленность, чем у АТФазы. Так, если при острой гиперкатехоламинемии активность НАДФЧН-диафоразы, ассоцированной с плазмолеммой кавеол, заметно угнеталась, в условиях ХС ее специфическое маркирование было интенсивнее, чем в контроле (рис. 7).
  Рис. 7. а – специфическое маркирование НАДФЧН-диафоразы в эндотелиоците аорты при ХЭБС; б – контроль (ув. 40 000).

Это свидетельствует об индуцированном патологическим процессом характере данной активности, что подтверждает и относительно невысокое специфическое контрастирование ФДЭ, определяющееся уровнем цГМФ, то есть каталитической способностью гуанилатциклазы, которая, в свою очередь, контролируется еNOS [10].

Обусловленное этим нарушение нормального ауто- и паракринного воздействия NO влечет за собой освобождение цитокинов и тем самым активацию значительно более метаболически эффективной, чем eNOS, Са2+-независимой индуцибельной NO-синтазы, которая локализуется в тех же структурах. Образующийся пероксинитрит вместе со свободным Са2+ повреждает цитомембраны, ограничивает анаэробное и аэробное воспроизводство АТФ, пластическую функцию, лабилизирует лизосомы, а так же неизбежно оказывает модифицирующее воздействие на содержимое МПВ и, прежде всего, на липопротеиды, транспортируемые ими как в субэндотелиальное пространство, так и в кровоток.

Изменения рецепторного аппарата и цитолеммы нарушали водно-электролитный баланс эндотелиоцитов и функцию их цитоскелета, который обеспечивает иммобилизацию интегральных протеинов плазмолеммы, определяет ее эластичность, участвует в экзо- и эндоцитозе, контролирует динамические изменения клеточной поверхности и межклеточных контактов.

Избыток свободного Са2+ и при наличии пальмитиновой кислоты и продуктов активируемого цитокинами фосфоинозитолового обмена, в частности, диацилглицерола, усиливал полимеризацию актина, способствуя реорганизации его филаментов в хорошо видимые под электронным микроскопом стресс-фибриллы (рис. 8а), через a-актинин и далее через a-, b- и g-катенины, ассоциирующиеся с главной Са2+-зависимой молекулой адгезии VE-катедрином, прочно связанным с плазмолеммой [14].

Дискоординация рецепторопосредованных регуляторных механизмов не только нарушает кинетику цитоскелета, но и влечет мозаичные более или менее значительные повреждения его элементов. Срабатывающий в обычных условиях Са2+-кальмодулинзависимый контррегуляторный механизм, который через eNOS – NO – цГМФ и далее через ФДЭ корригирует уровень цАМФ и в то же время стимулирует цГМФ-зависимую протеинкиназу I, освобождая клетку от избытка Са2+ и всех сопряженных с этим явлений, становится неэффективным.

Важнейшим следствием деформации эндотелиальных клеток являлась модификация межклеточных контактов и нарушение проницаемости эндотелиального монослоя, так как сокращение краев эндотелиоцитов с формированием межклеточных щелей – динамичный, контролируемый клеткой процесс, который реализуется через актин-миозиновый механизм ее цитоскелета (рис. 8б). Ведущую роль в гемо-тканевом обмене стенки сосуда выполняет не столько активный массоперенос посредством МПВ, сколько пассивная фильтрация.
 

Следствием неконтролируемого эндотелием повышения проницаемости стенки сосуда являлся субэндотелиальный отек с отслойкой эндотелиального монослоя, деструкцией фибриллярной инфраструктуры аморфного вещества субэндотелиальной зоны, накопление здесь грубодисперсных белков плазмы и продуктов нарушенного тканевого метаболизма. Ассоциируясь между собой, они преципитируют в этой зоне, провоцируя неспецифическую ответную реакцию с вовлечением форменных элементов крови и клеток стенки сосуда по мере своего развития к “системному воспалительному синдрому” [1].

Выводы

1. Под воздействием хронического стресса сосудистый эндотелий претерпевает ряд изменений, обусловливающих его дисфункцию с соответствующими структурно-метаболическими эквивалентами.
2. Хронический стресс трансформирует эндотелий из ключевого звена организменного гемостаза в самый обширный по площади и массивный по объему источник дестабилизирующих его гуморальных факторов, включая модифицирование липопротеидов.
3. С учетом универсального характера общего адаптационного синдрома, который при любых неблагоприятных воздействиях, истощающих компенсаторные возможности организма, трансформируется в хронический стресс, имеются основания рассматривать последний как ключевое звено атерогенеза, интегрирующее проатерогенные эффекты подавляющего большинства факторов риска атеросклеротического повреждения стенки сосуда. В соответствии с этим диагностику и снятие хронического стресса можно рассматривать как важный аспект профилактики атеросклероза и обусловленных им патологических состояний.

1. Братусь В.В., Шумаков В.А., Талаева Т.В. Атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, острый коронарный синдром. – К.: Четверта хвиля, 2004. – 575 с.
2. Гавриш А.С., Сергиенко О.В., Лисовец М.А., Лишневская В.Ю. Структурно-метаболические изменения сосудистого эндотелия и тромбоцитов при комплексном воздействии хронической гиперхолистеринемии и стресса // Укр. кардіол. журн. – 1999. – № 5. – С. 56-61.
3. Гайер Г. Электронная гистохимия. – М.: Мир, 1974. – 488 с.
4. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции. – М.: Мир, 1997. – 624 с.
5. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. – СПб.: Питер Ком, 1999. – 512 с.
6. Коваленко В.М., Дорогой А.П., Корнацький В.М. та ін. Смертність та інвалідність населення внаслідок серцево-судинних та судинно-мозкових захворювань – проблема сучасності // Укр. кардіол. журн. – 2003. – № 6. – С. 9-12.
7. Малая Л.Г., Корж А.Н., Балковая Л.Б. Эндотелиальная дисфункция при патологии сердечно-сосудистой системы. – Х.: Торсинг, 2000. – 432 с.
8. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. – М.: Медицина, 1984. – 272 с.
9. Морозов И.А., Хвыля С.И., Лысиков Ю.А., Чучкова Н.Н. Применение ОТО-метода при электронномикроскопических исследованиях // Архив патологии. – 1986. – № 6. – С. 82-84
10. Недоспасов А.А. Биогенный NO в конкурентных отношениях // Биохимия. – 1998. – № 63 (7). – С. 881-904
11. Непомнящих Л.М. Патологическая анатомия и ультраструктура сердца (Комплексное морфологическое исследование общепатологического процесса в миокарде). – Новосибирск: Наука, 1981. – 324 с.
12. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. – Новосибирск: Наука СО, 1983. – 232 с.
13. Теппермен Дж., Теппермен Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс. – М.: Мир, 1989. – 656 с.
14. Dejana E., Corada M., Lampugnani M. Endotelial cell to-cell junctions // FASEB J. – 1995. – Vol. 9. – P. 910-918.
15. Hope V.T., Vinsent S.R. Histochemical characterization of neural NADPH-diaphorase // Histochem. Cytochem. – 1989. – Vol. 37. – P. 653-651.
16. Ueno S., Bambaner H.J., Umar H., Ueck M. A new histo- and cytochemical method for demonstration of cyclic 3’,5’-nucleotide phosphodiesterase activity in retinal road photoreceptor cells of the rat // Histochemistry. – 1984. – Vol. 81, № 5. – Р. 445-451.

Morphology of dysfunction of vascular endothelium in chronic stress and atherogenesis

А.S. Havrysh

Chronic emotional-pain stress was modeled on rabbits with body weight 2,5–3,5 kg. Endothelium of aorta was investigated by means of electron microscopy and cytochemistry. According to the received data, chronic stress influence, stimulating oxidative processes and dyslipoproteidemia, sharply increases morphofunctional heterogeneity of the cells of endothelial monolayer, disturbing its antihemostatic properties and function as a key element of histochemical barrier. At the same time the vascular endothelium transforms from significant link of homeostasis into potent source of complex of biologically active substances and modified lipoproteids. Prevalent chronic stress in economically developed countries makes possible to consider it as universal component of atherosclerosis pathogenesis, integrating many risk factors of its pathological process. Diagnosis and treatment of chronic stress may be considered as an important aspect of prevention of atherosclerosis and its complications.