КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: свободнорадикальное окисление белков, перекисное окисление липидов, коронарный атеросклероз

В настоящее время считается общепризнанным, что избыточная продукция свободных радикалов и обусловленный ею оксидантный стресс являются важнейшими механизмами инициирования и прогрессирования различных сердечно-сосудистых заболеваний, в частности атеросклеротического процесса и ишемической болезни сердца [8, 9, 13, 15]. В последние годы в литературе накоплены многочисленные данные об активации и особенностях процессов перекисного окисления липидов при различных видах сердечно-сосудистой патологии [5, 10, 11]. Значительно меньше внимания уделяется вопросу о возможности и наличии в условиях оксидантного стресса свободнорадикальной модификации белковых структур. Вместе с тем, как свидетельствуют исследования последних лет, влияние активных форм кислорода наряду с липидами может распространяться и на белки, в том числе на белковые компоненты ферментов, рецепторов, ионных каналов плазматических мембран, определяющих возможность нормального функционирования различных клеток и тканей в целостном организме [12].

В литературе практически отсутствуют сведения о возможной роли свободнорадикальной модификации белков в биохимических механизмах становления и прогрессирования коронарного атеросклероза, формировании атерогенного потенциала крови, хотя такое направление исследований представляется достаточно важным. В предыдущих наблюдениях [4] мы показали, что у большинства больных с хронической ишемической болезнью сердца (ХИБС) имеет место интенсификация процессов свободнорадикального окисления не только липидов, но и белков крови, в том числе белков атерогенных липопротеидов – апопротеинов липопротеидов низкой (ЛПНП) и очень низкой (ЛПОНП) плотности.

Основная цель настоящей работы – изучение особенностей свободнорадикального окисления белков и липидов в условиях коронарного атеросклероза с учетом таких важнейших механизмов его прогрессирования, как активация воспалительных и аутоиммунных реакций.

Материал и методы

Материалом исследования была кровь 263 пациентов (174 мужчин и 89 женщин) с коронарографически верифицированным атеросклерозом сосудов сердца (ІІ–ІІІ функциональный класс (ФК)). Подбор больных и постановка диагноза были осуществлены сотрудниками отдела хронической ишемической болезни сердца. Интенсивность свободнорадикального окисления белков (СОБ) в сыворотке крови и апопротеиновых фракциях ЛПНП и ЛПОНП оценивали по содержанию продуктов этой реакции – 1,4-динитрофенилгидразонов (ФГ) [2]. Спектрофотометрически в сыворотке крови и в атерогенных липопротеидах определяли также уровни промежуточных и конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) – диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) [6, 7], c последующим расчетом индекса перекисной модификации атерогенных липопротеидов (ИПМАЛП) по разработанной нами методике*. Уровни общего холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) определяли на биохимическом анализаторе “Сiba-Corning” с использованием стандартных наборов реагентов. Коэффициент атерогенности рассчитывали общепринятым методом по А.Н. Климову. Методом электрофореза с использованием геля и последующей денситометрией (“Cormey”, Польша) исследовали состав липопротеидов в сыворотке крови. Активность ферментов антиоксидантной защиты – каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) – оценивали с использованием соответственно спектрофотометрического и флюориметрического методов [3, 14].

Критерием активации воспалительных реакций в условиях ХИБС было увеличение содержания в сыворотке крови больных фактора некроза опухоли a (ФНО-a) и интерлейкина-8 (ИЛ-8). В качестве показателя интенсификации аутоиммунного процесса использовали величину иммунорегуляторного индекса (отношение количества Т-хелперных лимфоцитов к количеству Т-супрессорных лимфоцитов) [1]. Этот показатель был верифицирован путем одновременного определения уровня аутоантител к компонентам стенки сосуда (более 20 усл. ед.).

Для изучения особенностей свободнорадикального окисления белков в зависимости от активации воспалительных и аутоиммунных реакций были сформированы 3 группы пациентов. Контрольную группу составили здоровые доноры. В 1-ю группу вошли больные с ХИБС без признаков активации воспалительных и аутоиммунных реакций. Во 2-ю группу включили пациентов с достоверным увеличением содержания в крови провоспалительных цитокинов (ФНО-a – 50 пг/мл и выше, ИЛ-8 – выше 10 пг/мл) и повышением иммунорегуляторного индекса (более 2 условных единиц) за счет низкого содержания Т-супрессорных лимфоцитов.

Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием метода сравнения средних величин и применением t-критерия Стьюдента для доверительного интервала (Р<0,05).

Результаты и их обсуждение

У больных 2-й группы при активации воспалительных и аутоиммунных реакций не наблюдали достоверных изменений уровней общего ХС и ТГ в крови (табл. 1), повышенных в целом у больных 1-й группы. Отчетливые изменения показателей регистрировали при исследовании количественного и качественного состава липопротеидов. У пациентов 2-й группы в условиях активации воспаления и аутоиммунных реакций изменялось соотношение атерогенных и антиатерогенных липопротеидов, в первую очередь, ЛПВП. При увеличении в крови количества воспалительных цитокинов и величины иммунорегуляторного индекса наблюдали дополнительное (в среднем на30,8 %) снижение уровня антиатерогенных липопротеидов (ЛПВП) по сравнению с таковым в 1-й группе. Уже у пациентов 1-й группы наблюдали значительное увеличение процентного содержания ЛПОНП по сравнению с таковым у лиц контрольной группы, однако у пациентов 2-й группы этот показатель существенно не отличался от такового у больных 1-й группы: наблюдали лишь слабую тенденцию к дополнительному нарастанию процентного содержания ЛПОНП. Регистрировали также качественные изменения состава липопротеидов: умеренное (в среднем на 23 %) снижение уровня ХС ЛПВП у больных 2-й группы по сравнению с пациентами 1-й группы. Такие изменения сопровождались нарастанием коэффициента атерогенности крови. Этот показатель, повышенный в целом у всех больных с ХИБС, в условиях активации воспалительных реакций дополнительно возрастал на 33,3 %. Такие неблагоприятные сдвиги у больных 2-й группы сочетались с умеренным дальнейшим нарастанием повышенного уровня ХС ЛПОНП (см. табл. 1).

Таблица 1 Показатели состава липидов и липопротеидов сыворотки крови больных с ХИБС в зависимости от активации воспалительного компонента и аутоиммунного процесса

Примечание. Различия показателей достоверны по сравнению с таковыми: * – у здоровых лиц; ° – у больных 1-й группы (Р<0,05). То же в табл. 2.

Наряду с указанными изменениями показателей липидного обмена в условиях активации воспалительного компонента и аутоиммунных реакций у больных с ХИБС наблюдали дополнительную интенсификацию свободнорадикальной модификации как липидов, так и белков.

При исследовании процессов ПОЛ было выявлено, что в условиях активации воспалительного процесса у больных достоверно увеличивалось (по сравнению с пациентами 1-й группы) содержание в крови промежуточных продуктов ПОЛ – ДК. Этот показатель был достоверно выше (в среднем на 35,7 %) у больных 2-й группы по сравнению с пациентами 1-й группы (табл. 2). Одновременно на фоне активации воспалительных реакций наблюдали увеличение содержания в крови и конечного продукта реакции – МДА (в среднем на 32,4 %).

Таблица 2 Показатели интенсивности свободнорадикального окисления белков и липидов, активность антиоксидантных ферментов у больных с ХИБС в зависимости от активации воспалительного компонента и аутоиммунных реакций

Проведенные исследования показали, что наиболее существенное снижение активности антиоксидантных ферментов каталазы и СОД отмечали у больных с ХИБС даже при отсутствии признаков воспалительного процесса. Активность каталазы снижалась в среднем на 32,8 % по сравнению с таковой у здоровых доноров, активность СОД – на 27,8 %. При активации воспалительного процесса у больных с ХИБС наблюдали умеренную тенденцию к дальнейшему истощению активности этих ферментов (в среднем соответственно на 9,5 и 9 %).

Несколько неожиданными оказались результаты исследования показателя ИПМАЛП, который, несмотря на признаки нарастания оксидантного стресса, в условиях активации воспаления лишь незначительно изменялся по сравнению с таковым у больных 1-й группы (см. табл. 2). Однако необходимо учитывать, что у больных с ХИБС даже при отсутствии интенсификации воспалительного процесса этот показатель увеличивался более чем в 3 раза.

Проведенные исследования показали, что наряду с усилением процессов ПОЛ активация воспаления в условиях ХИБС сопровождалась дальнейшей интенсификацией свободнорадикальной модификации белков. Следует подчеркнуть, что у большинства больных с ХИБС независимо от наличия воспалительных реакций существенно (в среднем на 84,8 %) увеличивался уровень продуктов СОБ сыворотки крови. При активации воспалительных реакций наблюдали тенденцию к дальнейшему увеличению этого показателя (в среднем на 15,3 %). Вместе с тем у больных с ХИБС без четких признаков нарастания воспалительных изменений выявляли только отчетливую тенденцию к увеличению показателя интенсивности процессов СОБ атерогенных липопротеидов (уровень ФГ в них возрастал в среднем на 17 %). Характерно, что именно активация воспалительных и аутоиммунных реакций явилась тем фактором, который сопровождался появлением достоверной интенсификации СОБ непосредственно в апопротеинах атерогенных липопротеидов – содержание ФГ в них достоверно возрастало в среднем на 36,9 % (см. табл. 2). Таким образом, именно активация воспалительных реакций с аутоиммунным компонентом способствовала тому, что наблюдаемая у всех больных с ХИБС тенденция к интенсификации процессов СОБ в атерогенных липопротеидах уступала место достоверным изменениям этих процессов, то есть воспаление явилось своеобразным “катализатором” свободнорадикальной модификации белков атерогенных липопротеидов.

Среди пациентов 2-й группы выделили подгруппу больных, у которых на фоне воспалительного компонента на момент обследования наблюдали наиболее выраженные признаки активации аутоиммунных реакций. Большинство показателей у этих пациентов существенно не отличалось от таковых в среднем по группе. Было отмечено лишь незначительное (на 8 %) увеличение количества промежуточных продуктов ПОЛ в сыворотке крови, в результате которого содержание ДК на 46,4 % превысило таковое у лиц контрольной группы.

Таким образом, при исследовании особенностей СОБ у больных с ХИБС в условиях активации воспалительных и аутоиммунных реакций было обнаружено, что эти изменения являются значимыми для дополнительного усиления свободнорадикальной модификации белков, в том числе в апопротеинах атерогенных липопротеидов. Характерно, что именно в условиях активации воспалительных реакций у больных с ХИБС были впервые получены данные о достоверной интенсификациипроцессов свободнорадикального окисления апопротеинов атерогенных липопротеидов в отличие от однонаправленной тенденции, проявлявшейся у всех больных с ХИБС не зависимо от активации воспаления и аутоиммунных реакций.

Выводы

1. В условиях хронической ишемической болезни сердца активация воспалительных реакций и аутоиммунных процессов сопровождается дополнительной интенсификацией процессов свободнорадикального окисления как липидов, так и белков по сравнению с их уровнем у всех больных с ишемической болезнью сердца.
2. Дополнительная интенсификация свободнорадикальной модификации белков атерогенных липопротеидов в условиях активации воспалительных и аутоиммунных реакций может явиться существенным механизмом прогрессирования атеросклеротического процесса.

1. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. – Москва, 2003. – 327 с.
2. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы мед. химии. – 1995. – Т. 41. – С. 24-26.
3. Определение активности каталазы в крови // Методы исследований в профпатологии / Под ред. О.Г. Архиповой. – М.: Медицина. 1988. – С. 156-157.
4. Орлова Н.Н., Мхитарян Л.С., Евстратова И.Н. и др. Структурно-функциональное состояние мембран кардиомиоцитов и форменных элементов крови при экспериментальном атеросклерозе в сочетании со стрессорными воздействиями // Укр. кардіол. журн. – 2000. – № 3. – С. 74-78.
5. Осипов А.Н., Борисенко Г.Г., Казаринов К.Д., Владимиров Ю.А. Оксид азота, гемоглобин и лазерное облучение // Вестник Рос.АМН. – 2000. – № 4. – С. 48-52.
6. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. – М.: Медицина, 1977. – С. 64-65.
7. Стальная И.Д. Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. – М.: Медицина, 1977. – С. 66.
8. Aglarz M., Jouyz R.V., Viel E.C. et al. Involvement of oxidative stress in the profibrotic action of aldosterone: interaction with the renin-angiotensin system // Amer. J. Hypertension. – 2004. – № 17. – P. 597-603.
9. Boucher J.L., Moali C., Tenu J.P. Nitric oxide biosynthesis oxide syntase inhibitors and arginase competition for L-arginine utilization // Cell. Mol. Life Sci – 1999. – Vol. 55. – № 8-9. – P. 1015-1028.
10. Carr A., Frei B. The role of natural antioxidants in preserving the biological activity of endothelium-derived nitric oxide// Free Rad. Biol. Med. – 2000. – Vol. 28. – P. 1806-1814.
11. Dean R.T., Fu S., Stocker R., Davies MJ. Biochemistry and pfthology of radical-mediated protein oxidation // Biochem. J. – 1997. – Vol. 324. – P. 1-18.
12. Dubey A., Forster M.J., Sohal R.S. Effect of age and caloric intake on protein oxidation in different brain regions and on behavioral functions of the mouse // Arch. Biochem. Biophys. – 1996. – Vol. 333. – № 1. – P. 189-197.
13. Fu S., Davies M.J., Stocker R., Dean R.T. Evidence for roles of radicals in protein oxidation in advanced human atherosclerotic plaque // Biochem J. – 1998. – Vol. 333. – P. 519-520.
14. Misra H., Fridovich I. Metod of determination superoxiddismutase activity in human erythrocytes // J. Biol. Chem. – 1972. – Vol. 244. – P. 6049-6055.
15. Ungvari L., Csiszar A., Kaminski P.M. et al. Chronic high pressure – induced arterial oxidative stress: involvement of protein kinase C-dependent NAD(P)H oxidase and local renin-angiotensin system // Amer. J. Pathology. – 2004. – Vol. 165. – P. 219-226.

The peculiarities of blood proteins and apoproteins of atherogenic lipoproteins free radical modification under conditions of coronary atherosclerosis

N.N. Orlova, L.S. Mkhitarian, I.N. Yevstratova, T.I. Gavrilenko, N.N. Vasilinchuk, T.F. Drobotko

The work is devoted to the study of peculiarities of proteins and lipids free radical oxidation under conditions of coronary atherosclerosis depending on the activation of inflammatory and autoimmune reactions. We studied blood serum of patients (174 men and 89 women) with atherosclerosis of coronary vessels (II–III functional class, after coronarography). The intensification of proteins free radical oxidation in blood serum and in fraction of lipoproteins low and very low density lipoproteins was appraised at concentration of product this reaction – 1,4-dinitrophenilgydrazones. The extension of content of tumornecrotic factor and interleykine-8 in patients blood was the criterion of activation of inflammatory reactions under conditions of chronic ischaemic heart desease. Immunoreactive index was the value of the intensification of autoimmune reactions. Under conditions of chronic ischaemic heart disease the activation of inflammatory reactions and autoimmune processes is accompanied by supplementary intensification of free radical oxidation of proteins and lipids above the typical level in all patients with ischaemic heart disease. Intensification of lipids and proteins of atherogenic lipoproteins free radical oxidation is accompanied by decreased activation of antioxydation enzymes – katalase and superoxyddismutase. The activation of inflammatory and autoimmune reactions under conditions of coronary atherosclerosis is important for supplementary intensification of proteins of atherogenic lipoproteins free radical modification. This may be very important in progressive atherosclerosis process.