КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: нейтрофильные гранулоциты, ишемическая болезнь сердца

В части І нашей работы были установлены особенности функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов (НГ) у больных со стабильной стенокардией (СС), нестабильной стенокардией (НС), инфарктом миокарда (ИМ) с зубцом Q и без него, но показатели представлены в относительных величинах. Нами выявлено снижение функциональной способности фагоцитов, степень выраженности которого зависела от формы и тяжести ишемической болезни сердца (ИБС), а также увеличение количества апоптозных клеток и активности щелочной фосфатазы у больных с острым коронарным синдромом (ОКС). Мы предположили, что недостаточность НГ у обследуемых нами больных может быть связана с несколькими факторами. Этому могут способствовать инфекционные агенты, истощение клеток в результате чрезмерных функциональных нагрузок. Наши данные позволили предположить также то, что относительное снижение активности НГ связано с увеличением количества клеток, склонных к апоптозу, которые теряют свои функциональные способности, особенно секрецию ферментов [5, 16].

В ходе эволюционного развития НГ приобрели такие свойства, которые в настоящее время свидетельствуют об их уникальных возможностях, большом функциональном потенциале, широких адаптационных способностях. Такая оценка полностью оправдывает представление о них не только как о центральном компоненте первой линии антибактериальной защиты, но и как об активном участнике поддержания иммунологического гомеостаза в норме и при патологии [2]. Очень часто сложность системы заставляет изучать отдельно ее звенья, искать нарушения отдельных этапов ее формирования и составлять заключение о ее сохранности лишь при гармонично сти всех ингредиентов. Для тонкой диагностики последнее положение особенно важно, поскольку надежность системы обусловливается взаимным перекрыванием отдельных элементов биологической защиты. Поэтому мы предположили, что при ИБС, особенно при ИМ с зубцом Q, повышение количества лейкоцитов может быть направлено на количественную компенсацию качественной недостаточности клеток.

В литературе встречаются работы, отражающие зависимость тяжести воспалительного процесса при ИБС от количества НГ в циркулирующей крови [3, 8,12].

Целью настоящей работы было определение функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с ишемической болезнью сердца с учетом абсолютного количества указанных клеток.

Материал и методы

Характеристика больных и методы иммунологического обследования подробно представлены в части І нашей работы. Все показатели функционального состояния НГ – уровень супероксиданиона (СОА), активность миелопероксидазы (МПО), кислой фосфатазы (КФ), количество НГ с внутриклеточными признаками апоптоза (НГ с ВКПА), экспрессия рецепторов CD11a и CD95 – изучались в чистой популяции клеток в концентрации 1Ч10⁶ на 1 мл питательной среды. Подсчет форменных элементов крови выполняли на аппарате “Advia” (Австрия) в клинической лаборатории Института кардиологии. Пересчет показателей в абсолютное количество проводили соответственно значениям формулы крови (количество лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, НГ).

Результаты и их обсуждение

Проведенные исследования показали, что количество форменных элементов было различно у больных разных групп и зависело от формы и тяжести заболевания (табл. 1).

Таблица 1 Абсолютные величины количества форменных элементов периферической крови

Примечание. * – различия показателей достоверны по сравнению с таковыми у лиц контрольной группы (P<0,05). То же в табл. 2, 3.

Установлено, что у больных с ИБС количество лимфоцитов практически не изменяется, количество моноцитов в равной степени повышается у всех больных, в то время как количество гранулоцитов, помимо повышения его у всех больных, резко отличается по группам. Отмечено увеличение количества данных клеток с нарастанием тяжести патологического процесса. У обследованных нами больных популяция гранулоцитов была представлена, в основном, НГ. Эозинофильные и базофильные гранулоциты встречались как единичные клетки.

В связи с большим разбросом абсолютного количества НГ у больных с ИМ с зубцом Q (коэффициент вариации – 41 %) эти пациенты были разделены на две группы: 1-я группа (n=12) – больные с умеренно повышенными величинами ((4,0±0,1)Ч109/л; общий лейкоцитоз – (5,8±0,2)Ч109/л), 2-я группа (n=19) – больные с высокими величинами (10,6±0,6)Ч109/л; общий лейкоцитоз – (13,2±0,6)Ч109/л).

НГ – самая многочисленная популяция лейкоцитов. Жизненный цикл НГ последовательно протекает в трех средах: костном мозге, крови и тканях. В норме почти три четверти НГ сосредоточено в костном мозге, причем большая часть из них – зрелые и функционально активные. Значительный резерв зрелых и созревающих НГ в костном мозге обеспечивает быстрое увеличение их содержания в крови при возросшей потребности в гранулоцитах в периферическом русле и тканях. В крови содержится лишь около 3 % всех НГ, а остальные функционируют в тканевых депо и на слизистых оболочках. В крови НГ циркулируют, по данным различных авторов, от 3 до 12 ч. Пребывание в крови является для НГ лишь способом перемещения из костного мозга к месту выполнения специфической функции (ткани, очаг воспаления). В крови НГ не могут осуществлять свои специфические функции. НГ сами транспортируют свой секреторный потенциал в нужное место, отыскивая мишени по градиенту концентрации хемоаттрактантов. Около 40 % НГ крови свободно циркулируют в ней, другие – прилипают к поверхности эндотелия сосудов и составляют пристеночный (маргинальный) пул. В норме между циркулирующим и маргинальным пулами наблюдается постоянный обмен. При стрессе, интенсивной мышечной работе, что, как правило, предшествует развитию ОКС, происходит мобилизация прилипших клеток в циркуляцию (до 100 %), развивается лейкоцитоз. Существует мнение, что циркулирующий пул состоит из более молодой популяции НГ, а пристеночный – из более старой. У человека ежедневно обменивается около 1,6Ч10⁹ клеток на 1 кг массы тела в сутки, благодаря чему, несмотря на громадный ростовой потенциал костномозговых предшественников, количество зрелых НГ поддерживается на постоянном уровне. Это объясняется непрерывной миграцией клеток из сосудистого русла [1, 4, 5, 11]. Миграция начинается с экспрессии в мембранах НГ особых белков адгезии – b2-интегринов (CD11a, b, c / CD18). Первичный импульс к их экспрессии поступает от других белков адгезии – Р- и Е-селектинов эндотелия. Экспрессия селектинов, в свою очередь, возрастает при любых нарушениях микроциркуляции и особенно резко – в зонах ишемии миокарда. Через селектины устанавливается слабый контакт лейкоцита с эндотелием, который затем сменяется более прочным через b2-интегрины с другими молекулами адгезии эндотелия – ICAM-1, 2, 3 [4, 6, 9]. Адгезия большого числа НГ к эндотелию венечных артерий затрудняет кровоток, создавая угрозу феномена отсутствия обратного кровотока в ходе реперфузии. Применение антител к CD11а в условиях реперфузии позволяет эффективно заблокировать трансмиграцию НГ, и у трансгенных мышей с их дефицитом экстравазия НГ в зону ишемии резко ослаблена [3, 6, 14].

НГ не возвращаются назад из тканей в циркулирующую кровь, подвергаясь элиминации с секретами слизистых оболочек, или быстро (в течение 2–6 сут) погибают в тканях. В нормальных условиях отмирание НГ происходит незаметно, несмотря на то, что они несут мощный биоагрессивный заряд и готовы реализовать его при многочисленных нарушениях гомеостаза. Механизмом, который “выводит клетки из игры”, не позволяя проявить свою агрессивность, является апоптоз. Характерными признаками апоптирующих НГ являются конденсация цитоплазмы, уплотнение и сохранение целостности плазматической мембраны и внутриклеточных органелл, агрегация, а затем расщепление ДНК, фрагментация клетки с образованием апоптозных тел. Морфологическая перестройка сопровождается снижением функциональной активности клеток. НГ, вступившие на путь апоптоза, теряют способность к поглощению, хемотаксису, респираторному взрыву, секреторной дегрануляции. Апоптозные клетки утрачивают способность к рецепторзависимой адгезии, хотя при этом наблюдается гиперэкспрессия адгезивных молекул (b2-интегринов), к которым относится семейство рецепторов CD11а, b и с [5, 9, 16].

По результатам исследования, количество НГ, экспрессирующих рецепторы адгезии (CD11a) и апоптоза (CD95), было высоким только у больных с ИМ, особенно у больных с ИМ с зубцом Q (табл. 2).

Таблица 2 Показатели адгезии и апоптоза нейтрофильных гранулоцитов у больных с ИБС в абсолютных величинах

CD95 или Fas-рецепторы задействованы в восприятии одного из апоптозных сигналов – FasL – и отражают лишь готовность к реализации апоптозной программы (точнее одного из ее механизмов), что не обязательно сочетается с ускорением апоптоза [5]. В регуляции апоптоза НГ важное место занимают также гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), g-интерферон, фактор некроза опухоли a, глюкокортикоиды [2, 5, 7]. Кроме того, по данным [14], апоптоз НГ регулируется и иммунными комплексами, которые его стимулируют. Эта форма регуляции апоптоза НГ в одних случаях зависит от респираторного взрыва, в других – происходит независимо от него.

По нашим данным, при ИБС у всех больных повышалось количество НГ с ВКПА, которое зависело от формы и тяжести ИБС. Так, если у больных с СС этот показатель только в 1,5 раза превышал таковой у здоровых лиц, то у больных с НС – в 2 раза, с ИМ без зубца Q – в 2,5 раза, а при ИМ с зубцом Q – уже в 4–5 раз.

Несмотря на это, количество НГ без ВКПА во всех обследуемых группах, кроме 2-й группы пациентов с ИМ с зубцом Q, оставалось в пределах физиологической нормы. У больных 2-й группы с ИМ с зубцом Q наблюдалось увеличение количества НГ без ВКПА в 2–3 раза. У этих пациентов при увеличении абсолютного количества клеток, склонных к апоптозу, все же наблюдается задержка апоптоза НГ.

Замедление апоптоза является важнейшим механизмом накопления НГ – процесс, в котором главенствующая роль принадлежит гранулоцитарно-макрофагальному колониестимулирующему фактору (ГМ-КСФ) и Г-КСФ [5, 15]. Антиапоптозным действием обладают и цитокины – ИЛ-2, 4, 6, 8, 10. Действие всех антиапоптических факторов во многом зависит от степени зрелости НГ и уровня экспрессии указанных интерлейкинов. Данные литературы свидетельствуют о том, что задержка апоптоза НГ может быть обусловлена также гипоксией, усиленной выработкой глюкокортикоидов [16], инфекцией или гиперэкспрессией рецепторов адгезии [5, 9]. Мы также наблюдали высокую положительную корреляцию (r=0,7, p<0,05) между абсолютным количеством НГ, несущих СD11а, и количеством НГ с ВКПА.

Гибель клеток запрограммирована на поддержание постоянного количества клеток, как в здоровом организме, так и при патологии, причем при патологии подключаются различные механизмы апоптоза, не только через CD95-рецепторы. У здоровых лиц количество НГ с ВКПА и НГ, экспрессирующих CD95, практически одинаково, и апоптозный индекс (НГ с ВКПА/CD95), предлагаемый нами, составляет 1,0±0,2. У больных с СС этот показатель был в пределах физиологической нормы – 1,3±0,1, тогда как у больных с ОКС – достоверно выше: с НС – 1,60±0,17, Р<0,05; с ИМ без зубца Q – 1,7±0,2, Р<0,05; у больных с ИМ с зубцом Q – 2,0±0,2, Р<0,05.

Накопление НГ является неблагоприятным фактором, не только поддерживающим, но и усугубляющим воспалительный процесс. В естественных условиях апоптозные клетки уничтожаются макрофагами, образующимися из моноцитов. Мы наблюдали повышение абсолютного количества моноцитов у больных с ИБС (см. табл. 1), практически одинаковое у всех обследованных. Моноциты не поглощают апоптозные НГ, но обретают такую способность после трансформации в макрофаги. Своевременному удалению апоптозных НГ придается большое значение в предупреждении и обратном развитии воспалительных реакций [5, 12]. Для характеристики данного процесса мы использовали соотношение количества НГ с ВКПА и моноцитов циркулирующей крови (контрольная группа – 1,2±0,1). У больных с СС этот показатель находился в пределах нормальных величин (1,4±0,1), тогда как у больных с ОКС соотношение указанных клеток было значительно выше и усугублялось с тяжестью патологического процесса (с НС – 2,2±0,3, Р<0,05; с ИМ без зубца Q – 2,6±0,3, Р<0,05; с ИМ с зубцом Q – 3,2±0,3, Р<0,05). Накопление НГ является неблагоприятным фактором в патогенезе заболевания, поскольку способствует развитию также аутоиммунных процессов.

В части I нашей работы было показано, что у больных с ИБС наблюдается функциональная недостаточность НГ, определяемая в 1 млн клеток по уровню СОА, МПО, каталазы, КФ, степень выраженности которой зависела от формы и тяжести патологического процесса.

Показатели функционального состояния НГ в пересчете на абсолютное количество клеток, то есть в цельной популяции, представлены в табл. 3. У большинства больных с ИБС уровни СОА, МПО и КФ НГ в абсолютных величинах были в пределах физиологической нормы, исключение составили больные 2-й группы с ИМ с зубцом Q. Нормальный уровень кислородных метаболитов и ферментов в цельной популяции НГ у больных с СС, НС, с ИМ без зубца Q и даже 1-й группы с ИМ с зубцом Q свидетельствует о сохранении компенсаторных возможностей организма в поддержании иммунологического гомеостаза при этих состояниях. Тем самым подтверждается наше предположение о том, что повышение количества воспалительных клеток у больных с ИБС направлено на компенсацию качественной недостаточности фагоцитов.

Таблица 3 Функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов у больных с ИБС в пересчете на абсолютное количество клеток

Особое место среди больных с ИБС занимают больные с ИМ с зубцом Q. Полученные результаты показали, что значительное увеличение количества НГ (более 6Ч109/л) у больных 2-й группы, несмотря на выраженную недостаточность клеток, приводит к накоплению деструктивного материала фагоцитов – СОА, МПО, КФ.

Для подтверждения предположения о том, что функциональная недостаточность НГ может быть триггером повышения количества НГ, был проведен корреляционный анализ между показателями метаболизма НГ в относительных величинах и абсолютным количеством НГ. У больных 2-й группы с ИМ с зубцом Q обнаружено высокую обратную зависимость уровня СОА в относительной клеточной единице от абсолютного количества НГ (r=-0,6, p<0,05). То есть, чем ниже уровень СОА в одной клеточной единице, тем выше абсолютное количество НГ. У остальных больных такой зависимости не наблюдали. Пока не ясна причина, по которой у одних больных (с НС, с ИМ без зубца Q, 1-й группы с ИМ с зубцом Q) выбрасывается практически столько НГ, сколько необходимо для компенсации их функциональной недостаточности, а у других (2-й группы с ИМ с зубцом Q) – происходит неконтролируемый выброс клеток, имеющий место при неблагоприятном течении заболевания. Полученные данные согласуются с результатами ранее проведенных клинических исследований в отделе реанимации Института кардиологии, свидетельствующими о неблагоприятном прогностическом значении выброса НГ в ранние сроки заболевания [13]. H.V. Barron и соавторы [8] отмечают, что у больных с большим количеством НГ снижаются эпикардиальный ток крови, перфузия миокарда, тромбоустойчивость, повы шается частота развития сердечной недостаточности и летальность.

В табл. 4 схематически отображена сравнительная характеристика функционального состояния НГ пациентов с различными формами ИБС. У больных с СС, НС, ИМ без зубца Q наблюдали, с одной стороны, снижение относительных показателей кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма и нормальные аналогичные абсолютные показатели, а с другой стороны – нормальное количество НГ, экспрессирующих CD11a, CD95, НГ с ВКПА, и повышение их абсолютного количества. Такая картина является, вероятно, адаптивной мерой организма для сохранения гомеостаза. У больных с ИМ с зубцом Q нормальное относительное количество CD11a, CD95 и резкое снижение относительных показателей кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма сопровождается значительным повышением их абсолютных показателей. В таком случае, являясь эффекторами воспалительной реакции, НГ могут усиливать повреждение тканей.

Таблица 4 Схематическое сравнение относительных и абсолютных величин метаболизма нейтрофильных гранулоцитов у больных с ИБС

Примечание. Ї – снижение показателей, ­ – повышение показателей, N – показатели в пределах физиологической нормы.

В норме (физиологическое состояние организма) лизосомные ферменты и окислительные агенты НГ, продуцированные при запуске фагоцитоза, осуществляют внутриклеточный катаболизм белков и других макромолекул, деградацию интра- и экстрацеллюлярных эндогенных субстратов, а также деградацию фагоцитированных вирусов и бактерий. При этом происходит интенсивное генерирование и высвобождение медиаторов воспаления в межклеточное пространство. Очищая очаг воспаления от тканевых субстратов, испытавших действие токсических продуктов этиологических факторов воспаления, НГ вовлекают в процесс и окружающие ткани. Степень вовлечения НГ в острое воспаление определяет или, по крайней мере, отражает глубину патологического процесса [6].

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что повышение количества НГ при ИБС до 5Ч109/л является адекватной реакци ей организма на воспаление, направленной на поддержание гомеостаза. Выброс НГ свыше 7Ч10⁹/л, выявленный у 61 % больных с ИМ с зубцом Q, является неконтролируемым процессом, который может привести к серьезным осложнениям патологического процесса. Увеличение количества НГ – это, прежде всего, компенсаторная реакция организма на стресс-воздействие, практически всегда предшествующее развитию ОКС. Повышение количества циркулирующих НГ при ИБС может быть за счет пристеночного пула клеток, что подтверждает увеличение количества НГ, экспрессирующих CD11а и НГ с ВКПА. Данные литературы [1, 5] свидетельствуют о том, что эти характеристики присущи именно стареющим НГ, которые и составляют, в основном, пристеночный пул клеток. С другой стороны, нейтрофилез может быть следствием массивного выброса клеток из костного мозга, что ведет за собой, как правило, истощение костномозгового депо и выброс функционально неполноценных клеток [2]. К сожалению, до сих пор специфических средств для уменьшения числа НГ не найдено [4], хотя существуют экспериментальные работы, показывающие, в частности, тормозящее влияние ибупрофена и других препаратов на инфильтрацию НГ в зону ишемии-реперфузии [6].

Выявление в венозной крови функционально неполноценных НГ может быть также следствием того, что активные НГ концентрируются и реализуют свои способности только в очаге воспаления, погибая там же и там же поглощаясь макрофагами, не возвращаясь в циркуляцию. Есть работы [10], которые свидетельствуют о том, что через 3 ч после коронарной окклюзии НГ концентрируются только в вене, но не в тканях.

В заключение можно сказать, что гетерогенность популяции НГ, отмечаемая многими исследователями [2, 5, 11], является одной из основных проблем в исследовании этих клеток. Функциональная активность популяции в целом не является сви детельством функциональной активности индивидуальной клетки внутри популяции, с другой стороны – функциональная активность индивидуальной клетки не отражает поведения популяции в целом. Только совмещение этих двух подходов к исследованию функции НГ, а именно параллельный учет относительных и абсолютных величин, позволяет адекватно оценить поведение популяции.

Литература

1. Алексеев Н.А. Клинические аспекты лейкопений, нейтропений и функциональных нарушений нейтрофилов. – СПб: Фолиант, 2002. – 416 с.
2. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Иммунология злокачественного роста. – К.: Наукова думка, 2005. – 792 с.
3. Братусь В.В., Шумаков В.А., Талаева Т.В. Атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, острый коронарный синдром: патогенез, диагностика, клиника, лечение. – К.: Четверта хвиля, 2004. – 576 с.
4. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. – Екатеринбург: УрО РАН, 2001. – 283 с.
5. Маянский А.Н., Маянский Н.А., Заславская М.И. и др. Апоптоз нейтрофилов // Иммунология. – 1999. – № 6. – С. 11-20.
6. Маянский Д.Н., Маянская С.Д. Роль нейтрофилов в ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда // Терапевт. арх. – 2001. – № 12. – С. 84-88.
7. Потапнев М.П. Цитокиновая сеть нейтрофилов при воспалении // Иммунология. – 1995. – № 4. – С. 34-40.
8. Barron H.V., Cannon C.P., Murphy S.A. et al. Association between white blood cell count, epicardial blood flow myocardial perfusion and clinical outcomes in the setting of acute myocardial infarction // Circulation. – 2000. – Vol. 102. – P. 2329-2334.
9. Dransfield I., Stocks S.C., Haslett C. Regulation of cell adhesion molecule expression and function associated with neutrophil apoptosis // Blood. – 1995. – Vol. 85. – P. 3264-3273.
10. Engler R.L., Dahlgren M.D., Peterson M.A. et al. Accumulation of polymorphonuclear leucocytes during 3h experimental myocardial ischemia // Amer. J. Physiology. – 1986. – Vol. 251. – P. 93-100.
11. Ferrari R., Agnoletti L., Comini L. et al. Oxidative stress during myocardial ischaemia and heart failure // Eur. Heart J. – 1998. – Vol. 19. – P. 2-11.
12. Mehta J., Dinerman J., Mehta P. et al. Neutrophil function in ischemic heart disease // Circulation. – 1989. – Vol. 79. – P. 549-556.
13. Kozhukhov S., Parkhomenko A. Administration of 5-lipoxygenaze inhibitor quercetin in patients with acute myocardial infarction and elevated white blood cells count: impact on necrotic zone and cardiac hemodynamics / Materials of 1 Congress of acute carsiac care working group of European Society of Cardiology. – 2004. – P. 58.
14. Ononello L., Frumento G., Arduino N. et al. Differential regulation of spontaneous and immune complex-induced neutrophil apoptosis: investigating the involement of oxidative and nonoxidative pathway // Free Radical. Biol. Med. – 2001. – Vol. 30. – P. 161-169.
15. Simon H.U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation // Immunol. Rev. – 2003. – Vol. 193. – P. 101-110.
16. Whyte M.K., Meager L.C., Mdermot J., Haslett C. Impairment of function in aging neutrophils is assosiated with apoptosis // J. Immunology. – 1993. – Vol. 150. – P. 5124-5134.

Сomparative description of the functional state of neutrophil granulocytes in patients with different forms of ischemic heart disease. Part II. Absolute quantities

N.A. Ryzhkova, T.I. Gavrilenko, A.N. Parkhomenko, A.N. Lomakovskiy, G.V. Ponomareva, Ya.M. Lutay, L.N. Kravchenko

We estimated the functional state of neutrocytes in patients with stable angina and acute coronary syndrome, counting the results obtained before in relative sizes into absolute indexes according to the values of blood formula. In patients with stable and unstable angina and non-Q-wave myocardial infarction we established normal absolute indexes of oxygen-dependent and oxygen-independent metabolism of neutrocytes and increase of absolute amount of cells able to adhesion and apoptosis, wish is, probably, due to adaptive reaction of organism for the maintenance of homeostasis. In patients with Q-wave myocardial infarction the considerable increase of absolute indexes of functioning of neutrocytes was noted. In this case, being the effectors of inflammatory reaction, neutrocytes can increase the damage of tissues. Thus, in order to evaluate the status of immune system, it is necessary to recalculate immunological indexes into absolute indexes.