КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ишемическая болезнь сердца, дисфункция эндотелия, патогенез, Helicobacter pylori, белки теплового шока

Проблема дисфункции эндотелия при сердечно-сосудистой патологии и в частности при ишемической болезни сердца (ИБС) вот уже более 10 лет является одной из наиболее актуальных и дискутабельных в современной кардиологии. Период активного накопления данных о наличии, степени выраженности, патогенетических механизмах формирования дисфункции эндотелия и возможностях терапевтического воздействия можно считать практически завершенным. На сегодняшний день продолжается период систематизации и анализа имеющихся уже фактов, а также уточнения некоторых малоизученных аспектов. В целом ряде исследований убедительно доказано наличие системной дисфункции эндотелия у больных с ИБС [12, 34], продемонстрирована тесная взаимосвязь между тяжестью атеросклеротического поражения коронарного русла и реакцией периферических сосудов на эндотелийзависимые вазодилататоры [2, 13, 15, 33].

В последние годы появилось большое число работ, в которых доказано непосредственное участие локального и системного воспаления в инициации и прогрессировании атеросклероза и его осложнений [21, 30], о чем, в частности, свидетельствует повышение в сыворотке крови больных с ИБС уровня С-реактивного белка, сиаловых кислот, фибриногена, плазминогена, общего числа лейкоцитов [1, 6, 19]. Доказательства того, что инфекция предрасполагает к развитию атеросклеротического поражения сосудов, были получены в исследованиях, в которых было прямо продемонстрировано наличие возбудителя инфекции в стенке пораженного атеросклерозом сосуда, а также в эпидемиологических исследованиях, показавших связь между патоген-специфическими антителами класса IgG и атеросклерозом [3, 5]. Первая подобная публикация показала значимость цитомегаловирусов [8], последующие продемонстрировали связь атеросклероза с вирусом герпеса типа 1 и 2 [9], С. pneumoniae [16], Н. pylori [7, 22], вирусом гепатита А [37].

Несмотря на наличие доказательств ассоциации между атеросклеротическим поражением артериальных сосудов и инфицированностью Н. pylori, взаимосвязь между дисфункцией сосудистого эндотелия и инфекцией Н. pylori, как и механизмы формирования эндотелиальной дисфункции на фоне инфекции Н. pylori, исследованы недостаточно.

Получены многочисленные доказательства ключевой роли белков теплового шока (БТШ) в биологии Н. pylori и в патофизиологии вызываемых им заболеваний. Так, показано, что БТШ способствуют адгезии Н. pylori к эпителию слизистой оболочки желудка, вовлекаются в механизмы воспаления, развивающегося в тканях макроорганизма, способствуя прогрессированию хронического воспаления в слизистой оболочке желудка благодаря экспрессии на клеточной поверхности Н. pylori БТШ семейства HSP70 [14].

С другой стороны, в ряде исследований была показана возможность индукции образования аутоантител к БТШ, которая стимулируется Н. pylori, что, по мнению авторов, может играть определенную роль в патогенезе Н. pylori-ассоциированного хронического гастрита и язвенной болезни [25]. Установлено, что среди всех БТШ наиболее часто молекулой-мишенью для индукции локального воспаления является человеческий HSP60. Как правило, гуморальный иммунный ответ против БТШ семейства HSP60 Н. pylori сильно выражен у пациентов с хеликобактерной инфекцией, что проявляется существенным увеличением уровня сывороточных антител класса IgG к БТШ Н. pylori, причем отмечается положительная корреляционная связь между титром антител к БТШ Н. pylori и степенью выраженности воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка [18]. Некоторыми исследователями высказывалось предположение о том, что иммунный ответ против перекрестно-реактивного эпитопа между HSP60 человека и Н. pylori может индуцировать повреждение тканей у лиц, инфицированных Н. pylori [32].

Цель исследования – изучить взаимосвязь дисфункции эндотелия с инфекцией Helicobacter pylori и механизмы ее формирования у больных с ишемической болезнью сердца, инфицированных Helicobacter pylori.

Материал и методы

Обследованы 50 пациентов (26 мужчин и 24 женщины в возрасте в среднем (44,21±1,71) года) с ИБС (стенокардия напряжения І–ІІ функциональных классов), у которых в анамнезе отмечались симптомы желудочной диспепсии, либо были диагностированы язвенная болезнь или хронический гастродуоденит. В исследование не включали пациентов с патологией, способной существенно повлиять на его результаты (сердечная недостаточность III–IV функциональных классов, почечная недостаточность, выраженная дислипидемия, клинические проявления атеросклероза другой локализации и др.) В качестве контроля обследованы 25 практически здоровых лиц. Все группы были сопоставимы по полу и возрасту пациентов.

Инфицированность Н. pylori определяли путем анализа содержания антител класса IgG к Н. pylori в сыворотке крови с помощью иммуноферментного набора фирмы “Equipar Diagnostici” (Италия) по прилагаемой к набору инструкции, полученный результат выражали в единицах. Наличие инфекции Н. pylori диагностировали в случае, если содержание антител класса IgG к Н. pylori в сыворотке крови превышало 20 ед.

О функциональном состоянии сосудистого эндотелия судили по активности фактора Виллебранда (ФВ) в периферической крови, которую определяли по ристомицин-индуцированной агрегации формалинизированных тромбоцитов микрометодом, разработанным в лаборатории кафедры госпитальной терапии-2 Запорожского государственного медицинского университета*.

Определяли уровень антител к БТШ семейства HSP-65 в сыворотке крови иммуноферментным методом, используя стандартную схему иммуноферментного анализа и принципы, изложенные в [28, 29]. В качестве антигена при этом использовали БТШ HSP-65 (“Sigma”). Оптическую плотность измеряли во всех образцах с целью отбора сывороток, дающих при определении антител к HSP-65 наибольшую оптическую плотность и, следовательно, содержащих наибольшее количество антител к HSP-65. В дальнейшем в работу брали предварительно скринированную сыворотку с наибольшей оптической плотностью, содержание которой принимали за 1000 условных единиц в 1 мл. Из указанной сыворотки готовили серийные разведения для постройки калибровочной кривой. Конечный результат выражали в условных единицах на 1 мл сыворотки.

В соответствии с поставленными целью и задачами все обследованные были разделены на две группы: 1-я группа (n=26) – больные с ИБС, инфицированные Н. pylori; 2-я группа (n=24) – пациенты с ИБС без признаков инфицирования Н. pylori. Контрольную группу составили 25 практически здоровых лиц.

Исследуемые величины представлены в виде: выборочное среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения. При проверке статистических гипотез нулевую гипотезу отбрасывали при уровне значимости менее 0,05. Достоверность различий между выборочными переменными, выраженными в количественной шкале, оценивали при помощи критерия Kruskal-Wallis, с последующим попарным сравнением групп при помощи критерия Dunn. Наличие и характер взаимосвязи между изучаемыми признаками оценивали, используя процедуру регрессионного анализа.

Результаты и их обсуждение

Группы существенно не отличались по количеству пациентов, их возрасту и половому составу. У пациентов 1-й группы отмечено значительное повышение содержания в сыворотке крови антител к Н. pylori (в 3,43 раза по сравнению с лицами контрольной группы и в 3,10 раза по сравнению с пациентами 2-й группы), при этом статистически значимых различий между обследованными 2-й и контрольной группы зарегистрировано не было (таблица).

Таблица Результаты обследования пациентов с ишемической болезнью сердца

Примечание. Различия показателей достоверны по сравнению с таковыми: * – в контрольной группе; ° – в 1-й группе (Р<0,05).

Дисфункцию эндотелия выявляли у пациентов как 1-й, так и 2-й группы. Однако если у пациентов 2-й группы активность ФВ превышала данный показатель у практически здоровых лиц на 20,26 %, то у пациентов 1-й группы – на 33,84 %; при этом статистически значимые различия по уровню активности ФВ были также зарегистрированы между пациентами 1-й и 2-й групп.

Особый интерес представляют результаты исследования уровня антител к HSP65 в сывороткекрови: у лиц контрольной группы он был на 50,9 % меньше, чем у пациентов 2-й группы, и на 76,45 % меньше, чем у пациентов 1-й группы. Более того, у пациентов 1-й группы уровень антител к HSP65 в сыворотке крови на 16,94 % превышал аналогичный показатель 2-й группы.

У больных с ИБС наблюдается существенное ухудшение функции сосудистого эндотелия, причем у пациентов с ИБС, инфицированных Н. pylori, степень выраженности дисфункции эндотелия существенно выше, чем у пациентов с ИБС, у которых не было выявлено инфекции Н. pylori. Это подтверждают и результаты регрессионного анализа: при включении в регрессионную модель активности ФВ в качестве зависимой переменной и уровня антител к Н. pylori в сыворотке крови в качестве независимой переменной, полученная зависимость с достаточной степенью адекватности аппроксимируется моделью простой линейной регрессии с уравнением Y=143,185+0,148X. При этом вариацию активности ФВ на 26,12 % можно было объяснить изменением уровня антител к H. pylori в сыворотке крови.

Учитывая тот факт, что у пациентов 1-й группы, характеризующихся более выраженной дисфункцией эндотелия, было выявлено также значительное повышение уровня в сыворотке крови антител к HSP65, не только по сравнению с практически здоровыми лицами, но и по сравнению с больными с ИБС, не инфицированными Н. pylori, следует предположить, что одним из факторов, способствующих увеличению степени тяжести дисфункции эндотелия на фоне инфекции Н. pylori, является перекрестная реактивность между БТШ семейства HSP65 Н. pylori и собственными БТШ семейства HSP65 макроорганизма.

Для проверки данной гипотезы нами был произведен регрессионный анализ, в котором в качестве независимой переменной регрессионной модели было использовано содержание в сыворотке крови антител к HSP65, а в качестве зависимой переменной – активность ФВ. Полученная зависимость аппроксимировалась моделью простой линейной регрессии (ее уравнение Y=74,549+0,417X, где Y – активность ФВ, а X – содержание в сыворотке крови антител к HSP65), при этом величина коэффициента детерминации для зависимой переменной с учетом всех степеней свободы составила 0,79. Иными словами – 79 % вариации активности ФВ может быть объяснено изменением содержания в сыворотке крови антител к HSP65, что доказывает значимость БТШ семейства HSP65 как независимого фактора формирования и прогрессирования дисфункции эндотелия у больных с ИБС, инфицированных Н. pylori.

Проанализируем, чем может быть обусловлена роль БТШ как факторов, усугубляющих дисфункцию сосудистого эндотелия на фоне инфекции Н. pylori. Известно, что основными внутриклеточными функциями БТШ являются их содействие в “сборке” белков и регуляция формирования мультимерных белковых комплексов, а также облегчение транслокации белков через многочисленные внутриклеточные мембраны [10]. БТШ также играют важную роль в селективном транспорте аномальных белков в лизосомы [26]. БТШ семейства HSP60 обусловливают устойчивость клеток к гипертермии и ишемии [4, 11], а семейства HSP65 на клеточном уровне способствуют регрессу роста опухолей и уменьшению туморогенности клеток [17]. Наиболее разнообразными функциями обладает семейство HSP70. Так, на клеточном уровне белки этого семейства обеспечивают толерантность к гипертермии, ишемии и/или гипоксии, восстановление ингибированных в ходе теплового шока процессов трансляции и транскрипции, регуляцию ответа на тепловой шок, устойчивость к воздействию эндотоксинов, уменьшение денатурации протеинов при воздействии теплового шока, туморогенность и клеточную пролиферацию, устойчивость к воздействию перекиси водорода, резистентность опухолевых клеток к клеткам моноцитарного ряда, чувствительность клеток к активированным киллерам, восстановление после индуцированной воздействием лекарственных препаратов блокады клеточного цикла, гликозилирование протеинов, апоптоз и резистентность клеток к апоптозу [23, 31]. На тканевом и органном уровнях HSP70 обеспечивают восстановление сократимости кардиомиоцитов после ишемии, способствуют уменьшению размера зоны инфаркта миокарда, повышению устойчивости миокарда к ишемическому повреждению [20], а также устойчивости гиппокампа к ишемическому повреждению [27].

Поскольку эндотелий является барьером между кровью и подлежащими тканями, он постоянно подвергается воздействию ряда физиологических и патогенных факторов, таких как напряжение сдвига, липополисахариды бактерий, окисленные липопротеины низкой плотности, цитокины и лихорадка, сопровождающая процессы воспаления, которые стимулируют продукцию эндотелием БТШ как универсальной реакции клетки на стресс для предотвращения повреждения клетки и обеспечения гомеостаза в стенке сосуда. Такая ситуация приводит к тому, что при прочих равных условиях, если оценивать удельную активность БТШ в различных клетках и органах по отношению к общему количеству синтезируемого белка за единицу времени, экспрессия БТШ в эндотелиальных клетках является максимальной, в связи с чем любая патологическая реакция, связанная с вовлечением системы БТШ, будет, прежде всего, проявляться в сосудистом эндотелии [36].

При помощи иммуногистохимии и иммуноблотинга было продемонстрировано, что колебания напряжения сдвига на сосудистом эндотелии вызывают экспрессию HSP60 в клетках эндотелия как in vitro, так и in vivo [24]. При этом, как правило, происходит внутриклеточное накопление БТШ, хотя в ряде работ была показана экспрессия HSP60 на поверхности подвергнутых воздействию измененного напряжения сдвига эндотелиальных клеток [35].

С учетом изложенных выше фактов можно объяснить и полученные нами данные. В частности наличие более выраженной дисфункции эндотелия у пациентов с ИБС, инфицированных Н. pylori, по сравнению с больными с ИБС без инфекции Н. pylori, может быть обусловлено перекрестной реактивностью между HSP65 Н. pylori и собственными HSP65 макроорганизма, максимальная экспрессия которых наблюдается в клетках сосудистого эндотелия; при этом накопление антител к БТШ семейства HSP65 в сыворотке крови приводит к усугублению уже имеющейся эндотелиальной дисфункции.

Выводы

1. У больных с ишемической болезнью сердца наблюдается четкая взаимосвязь дисфункции эндотелия и инфекции Н. pylori – при наличии последней степень выраженности дисфункции эндотелия существенно увеличивается.
2. Одним из важных патогенетических факторов, способствующих прогрессированию дисфункции эндотелия на фоне инфекции Н. pylori, является формирование и повышение уровня в сыворотке крови антител к белкам теплового шока.

1. Anderson J.L., Carlquist J.F., Muhlestein J.B. et al. Evaluation of C-reactive protein, an inflammatory marker, and infectious serology as risk factors for coronary artery disease and myocardial infarction // J. Amer. Coll. Cardiology. – 1998. – Vol. 32. – P. 35-41.
2. Anderson T.J., Uehata A., Gerhard M.D. et al. Close relation of endothelial function in the human coronary and peripheral circulations // J. Amer. Coll. Cardiology. – 1995. – Vol. 26. – P. 1235-1241.
3. Chuib В., Viira E., Tucker W., Fong I.W. Chlamydia pneumoniae, cytomegalovirus, and herpes simplex virus in atherosclerosis of the carotid artery // Circulation. – 1997. – Vol. 96. – P. 2144-2148.
4. Cumming D.V., Heads R.J., Watson A. et al. Differential protection of primary rat cardiocytes by transfection of specific heat stress proteins // J. Mol. Coll. Cardiology. – 1996. – Vol. 28. – P. 2343-2349.
5. Danesh J., Appleby P. Persistent infection and vascular disease: a systematic review // Exp. Opin. Invest. Drugs. – 1998. – № 7. – P. 691-713.
6. Danesh J., Collins R., Appleby P. et al. Association of fibrinogen, C-reactive protein, albumin, or leukocyte count with coronary heart disease: Meta-analyses of prospective studies // JAMA. – 1998. – Vol. 279. – P. 1477-1482.
7. Folsom A.R., Nieto F.J., Sorlie P. et al. Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study Investigators. Helicobacter pylori seropositivity and coronary heart disease incidence // Circulation. – 1998. – Vol. 98. – P. 845-850.
8. Grattan M.T., Moreno-Cabral C.E., Starnes V.A. et al. Cytomegalovirus infection is associated with cardiac allograft rejection and atherosclerosis // JAMA. – 1989. – Vol. 261. – P. 3561-3566.
9. Hajjar D.P., Pomerantz K.B., Falcone D.J. et al. Herpes simplex virus infection in human arterial cells: implications in atherosclerosis // J. Clin. Invest. – 1987. – Vol. 80. – P. 1317-1321.
10. Hayes S.A., Dice J.F. Roles of molecular chaperones in protein degradation // J. Cell. Biol. – 1996. – Vol. 132, № 3. – P. 255-258.
11. Heads R.J., Yellon D.M., Latchman D.S. Differential cytoprotection against heat stress or hypoxia following expression of specific stress protein genes in myogenic cells // J. Mol. Coll. Cardiology. – 1995. – Vol. 27. – P. 1669-1678.
12. Heras M., Senz G., Roig E. et al. Endothelial dysfunction of the non-infarct related, angiographically normal, coronary artery in patients with an acute myocardial infarction // Eur. Heart J. – 1996. – Vol. 17. – P. 715-720.
13. Hirooka Y., Egashira K., Imaizumi Т. et al. Effect of L-arginine on acetylcholine-induced endothelium-dependent vasodilatation differs between the coronary and forearm vasculatures in humans // J. Amer. Coll. Cardiology. – 1994. – Vol. 24. – P. 948-955.
14. Huesca M., Borgia S., Hoffman P., Lingwood C.A. Acidic pH changes receptor binding of Helicobacter pylori: a binary adhesion model in which surface heat-shock (stress) proteins mediate sulfatide recognition in gastric colonization // Infect. Immun. – 1996. – Vol. 64. – P. 2643-2648.
15. Kaku В., Mizuno S., Obsato K. et al. The correlation between coronary stenosis index and flow-mediated dilation of the brachial artery // Jpn. Circulat. J. – 1998. – Vol. 62. – P. 425-430.
16. Kaukoranta-Tolvanen S.S., Ronni Т., Leinonen M. et al. Expression of adgesion molecules on endothelial cells stimulated by Chlamydia pneumoniae // Microb. Pathog. – 1996. – Vol. 21. – P. 407-411.
17. Lukacs K.V., Lowrie D.B., Stokes R.W., Colston M.J. Tumor cells transfected with a bacterial heat-shock gene lose tumorigenicity and induce protection against tumors // J. Exp. Med. – 1993. – Vol. 178. – P. 343-348.
18. Macchia G., Massone A., Burroni D. et al. The Hsp60 protein of Helicobacter pylori: structure and immune response in patients with gastroduodenal diseases // Mol. Microbiol. – 1993. – № 9. – P. 645-652.
19. Manila K.J., Valtonen V.V., Nieminen M.S. et al. Role of infection as a risk factor for atherosclerosis, myocardial infarction, and stroke // Clin. Infect. Dis. – 1998. – Vol. 26. – P. 719-734.
20. Marber M.S., Mestril R., Chi S.H. et al. Overexpression of the rat inducible 70-kD heat stress protein in a transgenic mouse increases the resistance of the heart to ischemic injury // J. Clin. Invest. – 1995. – Vol. 95. – P. 1446-1456.
21. Mehta J.L., Saldeen T.G., Rand K. Interactive role of infection, inflammation and traditional risk factors in atherosclerosis and coronary artery disease // J. Amer. Coll. Cardiology. – 1998. – Vol. 31. – P. 1217-1225.
22. Mendall M.A., Goggin P.M., Molineaux N. et al. Relation of Helicobacter pylori infection and coronary heart disease // Brit. Heart J. – 1994. – Vol. 71. – P. 437-439.
23. Mosser D., Caron A., Bourget L. et al. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis // Mol. Coll. Biology. – 1997. – Vol. 17. – P. 5317-5327.
24. Multhoff G., Hightower L.E. Cell surface expression of heat shock proteins and the immune response // Cell Stress Chaperones. – 1996. – № 1. – P. 167-176.
25. Negrini R., Savio A., Graffeo M. Autoantibodies and gastric Helicobacter pylori infection: does autoimmunity affect progression to atrophic gastritis? // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. – 1993. – Vol. 5 (Suppl. 2). – P. 27-29.
26. Nollen E.A., Brunsting J.F., Roelofsen H. et al. In vivo chaperone activity of heat shock protein 70 and thermotolerance // Mol. Cell. Biol. – 1999. – Vol. 19. – P. 2069-2079.
27. Plumier J.C., Krueger A.M., Currie R.W. et al. Transgenic mice expressing the human inducible Hsp70 have hippocampal neurons resistant to ischemic injury // Cell Stress Chaperones. – 1997. –№ 2. – P. 162-167.
28. Pockley A.G., Bulmer J., Hanks B.M., Wright B.H. Identification of human heat shock protein 60 (HSP60) and anti-HSP60 antibodies in the peripheral circulation of normal individuals // Cell Stress Shaperones. – 1999. – Vol. 4. – P. 29-35.
29. Pockley A.G., Shepperd J., Corton J.M. Detection of heat shock protein 70 (HSP70) and anti-HSP70 antibodies in the serum of normal individuals // Immunological Investigations. – 1998. – Vol. 27. – P. 367-377.
30. Ridker P.M., Cushman M., Stampfer M.J. et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men // New Engl. J. Med. – 1997. – Vol. 336. – P. 973-979.
31. Schoel В., Kaufmann S.H. The unique role of heat shock proteins in infections // Stress Proteins in Medicine. – N.Y.: Marcel Dekker, 1996. – P. 27-51.
32. Sharma S.A., Miller G.G., Peek R.A. et al. T-cell, antibody, and cytokine responses to homologs of the 60-kilodalton heat shock protein in Helicobacter pylori infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 1997. – № 4. – P. 440-446.
33. Testa M., Biasucci L.M., Cacciola M. et al. Variable response of the peripheral circulation to acetylcholine in patients with coronary artery disease // Amer. J. Cardiology. – 1996. – Vol. 77. – P. 149-153.
34. Tousoulis D., Tentolouris C., Crake Т. et al. Basal and flow-mediated nitric oxide production by atheromatous coronary arteries // J. Amer. Coll. Cardiology. – 1997. – Vol. 29. – P. 1256-1262.
35. Xu Q., Schett G., Seitz C.S. et al. Surface staining and cytotoxic activity of heat-shock protein 60 antibody in stressed aortic endothelial cells // Circ. Res. – 1994. – Vol. 75. – P. 1078-1085.
36. Xu Q., Wick G. The role of heat shock proteins in protection and pathophysiology of the arterial wall // Mol. Med. Today. – 1996. – Vol. 2. – P. 372-379.
37. Zhu J., Quyyumi A., Norman J.E. et al. Potential role of hepatitis A virus in coronary artery disease // J. Amer. Coll. Cardiology. – 1999. – Vol. 33. – P. 4-12.

Endothelial dysfunction development mechanisms in patients with ischemic heart disease infected with Helicobacter pylori

S.N. Polyvoda, A.A. Cherepok, R.A. Sychov

The aim of the study was to investigate interrelationship between endothelial dysfunction and Helicobacter pylori infection, mechanisms of endothelial dysfunction development in patients with ischemic heart disease infected with Helicobacter pylori. Fifty patients with ischemic heart disease and 25 practically healthy persons were examined. Helicobacter pylori infection diagnosis was based on blood serum IgG antibodies to H. pylori content determined by immune enzyme assay. Blood serum content of antibodies to HSP-65 family of heat shock proteins was determined by immune enzyme assay. Von Willebrand factor activity in peripheral blood was determined for endothelial dysfunction assessment. Endothelial dysfunction was detected in patients infected and not infected with H. pylori, but was significantly more pronounced in infected patients. Significant elevation of antibodies to HSP-65 family of heat shock proteins were fixed in examined patients, more pronounced in patients infected with H. pylori. Regression analysis results showed significant interrelationship between von Willebrand factor activity and both the level of antibodies to H. pylori and the level of antibodies to HSP-65. It was supposed that significant elevation of antibodies to HSP-65 heat shock proteins in blood serum plays a key role in endothelial dysfunction development and progression in patients infected with H. pylori.